Summary
המכשיר microfluidic perifusion איון פותחה להערכת הפרשת אינסולין הדינמי של איים רבים דימות פלואורסצנטי סימולטני של זרם סידן שינויים אפשריים המיטוכונדריה.
Abstract
המכשיר microfluidic perifusion איון פותחה להערכת הפרשת אינסולין הדינמי של איים רבים דימות פלואורסצנטי סימולטני של זרם סידן שינויים אפשריים המיטוכונדריה. המכשיר מורכב משלוש שכבות: השכבה הראשונה כוללת מערך של בארות microscale (500 מיקרומטר ו בקוטר 150 מיקרומטר עומק) המסייעים כדי לשתק את איים בעוד חשופים תזרים ולהגדיל את שטח הפנים חשוף של איים, את השכבה השנייה מכילה מעגלי perifusion קאמרית (3 מ"מ עמוקה, בקוטר 7 מ"מ); ואת השכבה השלישית מכילה ערוץ מפרצון-ערבוב כי האוהדים לפני הזרקה לתוך תא perifusion (2 מ"מ רוחב, 19 מ"מ אורך, 500 מיקרומטר גובה) לייעול את היעילות ערבוב לפני הכניסה לתא perifusion. יצירה של גלוקוז הדרגתיים שונים, כולל צורה ליניארית פעמון, צורות מרובע גם ניתן ליצור רשת perifusion microfluidic והוא הוכיח.
Protocol
א Microfabrication של המכשיר microfluidic 3-שכבת perifusion
ובכן התחתונה מאסטר Protocol (150 מיקרומטר בארות עמוקים)
- נקו את רקיק באמצעות סכין גילוח במידת הצורך. ניקוי עם אצטון, מתנול, ו IPA. בצע טיפול פלזמה ב 50 וואט במשך 30 s.
- ספין SU8-100 @ 2000 סל"ד. [שלב 1: 500 סל"ד, 10 שניות, 100 סל"ד / s, שלב 2: 2000 סל"ד, 30 שניות, 300 סל"ד / s].
[הערה: לא להחזיק את רקיק עם פינצטה לאחר ספינינג SU8] - לאפות Soft רקיק על 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ו - ב 95 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות.
- רקיק הוא נחשף לאור UV באמצעות מסכה הרצוי. מנה עבור גובה 150 מיקרומטר הוא 650 mJ / 2 ס"מ.
- חשיפה הודעה לאפות את רקיק ב 65 ° C ו - 1 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.
- פיתוח ב רקיק מפתח SU8 במשך 15 דקות.
מאסטר פרוטוקול microchannel (500 מיקרומטר בארות עמוקים)
- נקו את רקיק באמצעות סכין גילוח במידת הצורך. ניקוי עם אצטון, מתנול, ו IPA. בצע טיפול פלזמה ב 50 וואט במשך 30 s.
- ספין SU8-2150 @ 1000 סל"ד. [שלב 1: 500 סל"ד, 10 שניות, 100 סל"ד / s, שלב 2: 1000 סל"ד, 30 שניות, 300 סל"ד / s].
- לאפות Soft רקיק על 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ו - ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ו 30 דקות.
- רקיק הוא נחשף לאור UV באמצעות מסכה הרצוי. מינון חשיפה עבור גובה 650 מיקרומטר הוא 685 mJ / 2 ס"מ.
- חשיפה הודעה לאפות את רקיק ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דק 'ו ב 95 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות.
- פיתוח ב רקיק מפתח SU8 20-30 דקות.
PDMS הכנה פתרון
- Polydimethylsiloxane (PDMS) פתרון מוכן ביסודיות על ידי ערבוב 10 חלקים אלסטומר סיליקון עם חלק 1 של סוכן ריפוי של ערכת Sylgard תקן 184.
- בועות שנוצרו בתמיסה PDMS במהלך תהליך ערבוב מוסרים באמצעות ייבוש ואקום.
- בועה נטולת הפתרון PDMS הוא חילק לאט אל SU8 אדונים צלחת פטרי ריק עבור השכבה השלישית.
- הטמפרטורה של הפלטה החשמלית מוגדר 75 ° C ו PDMS נירפאים בטמפרטורה זו למשך 2 שעות
- פתחי הכניסה, שקעי ובארות החליפין חבט החוצה באמצעות אגרופן חור בגודל המתאים.
- שכבות מחוברים יחד בשקופית זכוכית (0.1 מ"מ גודל) באמצעות מכשיר פלזמה כף יד.
ב ניסויית ההתקנה
- אתנול תזרים 70% באמצעות מכשיר המיקרו לעקר. תזרים די מים כדי לשטוף את אתנול. Perfuse 50 מ"ל של BSA 0.5% דרך המכשיר כדי למנוע ספיחה לא ספציפית של אינסולין על הקירות microchannel.
- הכבש גלוקוז שיפוע והדרגות אחרים הקשורים שנוצר על ידי תוכנת LabVIEW כי מתקשר עם המזרק משאבות נבדקו כדי לוודא הדרגתיים הם יציבים.
- 25-30 איים עכברים הודגרו עם Fura-2/AM 5 מיקרומטר (אינדיקטור סידן, בדיקות מולקולריות, CA) ו - 2.5 מיקרומטר Rhodamine 123 (Rh123, מחוון המיטוכונדריה הפוטנציאלים, Sigma, MO) למשך 30 דקות ב 37 מעלות קרבס-Ringer חיץ (KRB) המכיל 2 גלוקוז mM
- איים העכברים הם pipetted בזהירות דרך נמל כניסת למכשיר perifusion microfluidic.
- רשת microfluidic לאחר מכן ההתקנה על ידי חיבור אל כניסת משאבות מזרק באמצעות צינורות Tygon ו-Y מחבר ולשקע לאספן חלק. המכשיר יושב על שלב החימום (37 ° C) על המיקרוסקופ ואת צינורות כניסת מחומם על פלטה חמה כדי לשמור על הטמפרטורה של החדר פתרון בשעה 37 ° C.
- מיד לאחר ההתקנה, איים העכברים הם perifused עם KRB המכיל גלוקוז 2 מ"מ עבור 10 דקות ולאחר מכן כבש גלוקוז (2mm 25mm) עבור 25 דקות.
- זמן לשגות תמונות שנאספו ונותחו כל זה 15 על ידי תוכנת SimplePCI. Perifusate נאסף גם כל דקה באמצעות אספן חלק לנתח את הפרשת האינסולין באמצעות ערכת ELISA.
נציג תוצאות
איים עכבר היו perifused עם שיפוע ליניארי של גלוקוז 2-25 מ"מ. כפי שניתן לראות בתרשים 1, זרם סידן הפרשת אינסולין מופעלות לאחר כ 13 דקות של perifusion, המתאים גלוקוז 6 מ"מ. השינויים הפוטנציאלים מיטוכונדריאלי נתפסים מוקדם כצפוי, בערך 11 דקות. מידע זה מדגים את היתרון של שימוש ברשת microfluidic לאפיין איון הפיזיולוגיה.
באיור 1. התגובות הפיזיולוגיות כדי איון גירוי התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מסורתית perifusion איון מערכות (macroscale ו microscale) יש מגבלות כולל המורכב של הגדרת העיצוב, דרישות טכניות גבוהות, קושי ליצור למשתמש שנקבעו הדרגתיים כימיים במערכת. מערכת perifusion microfluidic המתואר כאן מתגבר על המגבלות האלה עם גיאומטריה פשוטה של עיצוב ייצור. חשוב מכך, מערכת זו יכולה להיות משולבת עם גישה דימות פלואורסצנטי המספקים ככלי ייחודי ללמוד איון הפיזיולוגיה. מערכת הפגינו עם יחס אות לרעש גבוה של המרחב וזמן ברזולוציה של האותות הללו פלואורסצנטי. מכשיר אב הטיפוס הנוכחי גם יכול להחזיק setups perifusion מספר שבב אחד ולספק סוגים שונים של microenvironments לצורך יישום נרחב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי AAUW הבינלאומי המילגה כדי Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) על חוזה Oberholzer, והפרויקט סוכרת שיקגו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
