Tillämpning av Stoppad-flöde Kinetics metoder för att undersöka verkningsmekanismen av en DNA Repair Protein
Summary
MSH2-Msh6 är ansvarig för att initiera reparation av replikering fel i DNA. Här presenterar vi ett övergående kinetik strategi för att förstå hur denna kritiska proteinet fungerar. Rapporten belyser slutade flöde experiment för att mäta det kopplade DNA-bindande och ATPas kinetik underliggande MSH2-Msh6 verkningsmekanism i DNA-reparation.
Abstract
Övergående kinetisk analys är nödvändig för att förstå fungerar biologiska makromolekyler, eftersom denna metod ger mekanistiska information inklusive aktiva site koncentrationer och inneboende konstanter takt som styr makromolekylära funktion. I händelse av enzymer, till exempel, övergående eller pre-steady state mätningar identifiera och karaktärisera enskilda händelser i reaktionen väg, medan steady-state mätningar endast ger övergripande katalytisk effektivitet och specificitet. Enskilda händelser som protein-protein eller protein-ligand interaktioner och hastighetsbestämmande konformationsändringar förekommer ofta i millisekund tid, och kan mätas direkt med stoppade flöde och kemisk-släcka flöde metoder. Med tanke på en optisk signal som fluorescens, stannade-flöde fungerar som ett kraftfullt och lättillgängligt verktyg för att övervaka reaktion framsteg från substrat binda till produktlansering och katalytisk omsättningen 1,2.
Här rapporterar vi tillämpa slutade flöde kinetik att söka av verkningsmekanismen för MSH2-Msh6, en eukaryot DNA-reparation protein som erkänner baspar obalanser och insättning / borttagning loopar i DNA och signaler mismatch reparation (MMR) 3-5. På så sätt hjälper MSH2-Msh6 ökar noggrannheten i DNA-replikation av tre tiopotenser (felfrekvens minskar från ~ 10 -6 till 10 -9 baser), och därmed bevara genomisk integritet. Inte överraskande är defekt mänsklig MSH2-Msh6 funktion i samband med ärftlig icke-polypos tjocktarmscancer och andra sporadiska cancerformer 6-8. För att förstå verkningsmekanismen av denna kritiska DNA metabola protein, vi sondera dynamiken i MSH2-Msh6 interaktion med inkompatibla DNA samt ATPas aktivitet som drivmedel sitt handlande i MMR. DNA-bindande mäts genom att snabbt blanda MSH2-Msh6 med DNA som innehåller en 2-aminopurine (2-Ap) fluoroforen anslutning till ett G: T obalans och övervaka den resulterande ökningen i 2-aminopurine fluorescens i realtid. DNA dissociation mäts genom att blanda förformade MSH2-Msh6 G: T (2-Ap) mismatch komplex med omärkta fälla DNA och övervakning minskning fluorescens över tiden 9. Pre-steady state ATPas kinetik mäts genom förändringen i fluorescens av 7-dietylamino-3-((((2-maleimidyl) etyl) amino) karbonyl) kumarin)-märkta fosfat bindande protein (MDCC-PBP) om bindande fosfat ( Pi) släpptes av MSH2-Msh6 efter ATP hydrolys 9,10.
Uppgifterna visar en snabb bindning av MSH2-Msh6 till ett G: T obalans och bildandet av ett långlivat MSH2-Msh6 G: T komplex, vilket i sin tur resulterar i hämning av ATP hydrolys och stabilisering av protein i en ATP-bunden form . Den reaktionskinetik ger tydligt stöd för hypotesen att ATP-bundet MSH2-Msh6 signaler DNA-reparation om bindande ett omaka baspar i dubbelspiral.
F. Noah Biro och Jie Zhai bidragit till detta papper lika.
Protocol
Discussion
Exemplet med en DNA mismatch protein som beskrivs här illustrerar kraften och nyttan av övergående kinetiska metoder för att studera de mekanismer av biologiska molekyler. Stoppad-flödesmätning om den gemensamma omsättningen tidsskalan som entydiga bevis för snabb och specifik bindning av MSH2-Msh6 protein till ett omaka baspar och bildandet av ett långlivat protein X DNA-komplex i reaktionen 9. Dessutom tillhandahålls slutade-flöde (och släcka-flöde) analys av ATPas aktivitet direkta bevis för …
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en NSF KARRIÄR Award (MMH), en Barry M. Goldwater stipendium (FNB) och en ASBMB Grundutbildning Research Award (CWD). Den klon för över-uttryck av PBP var vänligt tillhandahålls av Dr Martin Webb (MRC, Storbritannien).
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
References
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. E. . Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).
- Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
- Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
- Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
- Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. . DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
- Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
- Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).
- Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O’Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
- Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).
- Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
- Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).
