Toepassing van Stopped-flow Kinetics Methoden om het werkingsmechanisme van een DNA Repair eiwit Onderzoek
Summary
MSH2-MSH6 is verantwoordelijk voor het initiëren reparatie van replicatie fouten in DNA. Hier presenteren wij een voorbijgaande kinetiek benadering begrijpen hoe deze kritische eiwit werkt. Het rapport toont gestopt-flow experimenten voor het meten van de gekoppelde DNA-binding en ATPase kinetiek onderliggende MSH2-MSH6 werkingsmechanisme bij DNA-herstel.
Abstract
Transient kinetische analyse is onmisbaar voor het begrijpen van de werking van biologische macromoleculen, omdat deze aanpak levert mechanistische informatie met inbegrip van actieve website concentraties en de intrinsieke groeisnelheid constanten die macromoleculaire functie regeren. In het geval van enzymen, bijvoorbeeld, voorbijgaande of pre-steady-state metingen identificeren en karakteriseren van afzonderlijke gebeurtenissen in de reactie weg, terwijl de steady state metingen alleen yield algemene katalytische efficiëntie en specificiteit. Individuele gebeurtenissen zoals eiwit-eiwit of eiwit-ligand interacties en snelheidsbeperkende conformationele veranderingen komen vaak voor in de milliseconde tijdschaal, en kunnen direct worden gemeten door gestopt-flow en chemische-lessen stroom methoden. Gegeven een optisch signaal, zoals fluorescentie, stopte-flow dient als een krachtig en toegankelijk instrument voor het toezicht op de voortgang reactie van substraat binding aan productversie en katalytische omzet van 1,2.
Hier melden wij de toepassing van stopten-flow kinetiek naar het werkingsmechanisme van MSH2-MSH6, een eukaryotische DNA-reparatie-eiwit dat base-paar mismatches en insertie / deletie loops in DNA en signalen mismatch repair (MMR) 3-5 herkent sonde. Daarbij, MSH2-MSH6 verhoogt de nauwkeurigheid van DNA-replicatie door drie ordes van grootte (fout frequentie af van ~ 10 -6 tot 10 -9 bases), en dus helpt bij het beschermen genomische integriteit. Niet verrassend, is gebrekkige menselijke MSH2-MSH6 functie in verband met erfelijke niet-polypose colonkanker en andere vormen van kanker sporadische 6-8. Om het werkingsmechanisme van deze cruciale DNA metabole eiwitten te begrijpen, zijn we het sonderen van de dynamiek van MSH2-MSH6 interactie met de verkeerde DNA evenals de ATPase activiteit die brandstoffen zijn acties in BMR. DNA-binding wordt gemeten door snel mengen MSH2-MSH6 met DNA met een 2-aminopurine (2-Ap) fluorofoor grenzend aan een G: T mismatch en bewaken van de daaruit voortvloeiende toename van 2-aminopurine fluorescentie in real time. DNA dissociatie wordt gemeten door het mengen van voorgevormde MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) mismatch complex met niet-gemerkte DNA-trap en monitoring afname in fluorescentie na verloop van tijd 9. Pre-steady state ATPase kinetiek worden gemeten door de verandering in de fluorescentie van 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl) ethyl) amino) carbonyl) coumarine)-gelabeld fosfaat bindend eiwit (MDCC-PBP) op de binding fosfaat ( pi) uitgebracht door MSH2-MSH6 volgende ATP hydrolyse 9,10.
Uit de gegevens blijkt een snelle binding van MSH2-MSH6 naar een G: T mismatch en de vorming van een langlevende MSH2-MSH6 G: T complex, wat op zijn beurt resulteert in onderdrukking van ATP hydrolyse en stabilisatie van het eiwit in een ATP-gebonden vorm . De reactie kinetiek duidelijke ondersteuning voor de hypothese dat ATP-gebonden MSH2-MSH6 signalen DNA-herstel op een verkeerde binding basepaar in de dubbele helix.
F. Noah Biro en Jie Zhai bijgedragen aan dit document ook.
Protocol
Discussion
Het voorbeeld van een DNA mismatch bindend eiwit hier beschreven illustreert de kracht en het nut van voorbijgaande kinetische methoden voor het bestuderen van de mechanismen van biologische moleculen. Stopped-flow metingen op de single omzet tijdschaal voorzien ondubbelzinnig bewijs voor een snelle en specifieke binding van MSH2-MSH6-eiwit aan een verkeerde basenparen en de vorming van een lange levensduur eiwit X DNA-complex in de reactie 9. Bovendien stopte-flow (en lessen-flow) analyse van de ATPase activ…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een NSF Career Award (MMH), een Barry Goldwater M. beurs (FNB) en een ASBMB Undergraduate Research Award (CWD). De kloon voor de over-expressie van PBP werd vriendelijk verschaft door Dr Martin Webb (MRC, Verenigd Koninkrijk).
Materials
| DNA name | Sequence |
| 37 G | 5′- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3′ |
| 37 T (2-Ap) | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
| 37 T | 5′- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3′ |
References
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. E. . Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).
- Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA. Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).
- Lamers, M. H. The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch. Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).
- Warren, J. J. Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex. Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).
- Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. . DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hsieh, P., Yamane, K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).
- Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair. J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).
- Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein. DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair. Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).
- Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O’Donnell, M. Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy. Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).
- Zhai, J., Hingorani, M. M. S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Brune, M. Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli. Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).
- Antony, E., Hingorani, M. M. Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA. Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).
- Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch. Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).
- Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA. Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).
