Immunocytochemische analyse van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een Self-Made Cytospin Apparatuur

Summary

Opschorting immunocytochemische kleuring van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) voor het celoppervlak markers (SSEA-3/SSEA-4) werd bereikt op basis van het gebruik van een zelfgemaakte Cytospin apparaat tot een monolaag van cellen voor observatie en kwantificering te creëren.

Abstract

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) dat de menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) en de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) omvatten zijn spannende cel bronnen door hun grenzeloze zelfvernieuwing mogelijkheden en hun potentieel om te differentiëren in verschillende celtypes. De pluripotente toestand van hPSCs wordt meestal bepaald door technieken zoals qPCR, immunocytochemie, en door andere<em> In vitro</em> En<em> In vivo</em> Het hanteren van strategieën in meerdere celtypen. Onder deze, zijn immunocytochemische technieken ontwikkeld voor routine karakterisering van de ongedifferentieerde toestand van hPSCs gebaseerd op een analyse van de kandidaat-intracellulaire en cel-oppervlak van biomarkers. Gezien het feit dat hPSCs groeien als kolonies, problemen ontstaan ​​bij het kwantificeren van de expressie van deze markers op individueel celniveau op een routine-basis. Flowcytometrie analyses dienen om dit probleem aan te pakken, maar moet het aantal cellen en van de reagentia die normaal niet bevorderlijk voor routine kwaliteitscontrole beoordeling van hPSC culturen gebruiken. Zo is de ontwikkeling van praktische en reproduceerbare middel om monolaag cel monsters met bewaard integriteit voor marker evaluatie heeft vele voordelen in het stamcelonderzoek. Dit heeft veel baat immunocytochemische analyse, omdat de individuele cellen van de monolaag kunnen gemakkelijk worden waargenomen en gekwantificeerd voor de expressie van specifieke markers. Dit doel te bereiken, was een self-made Cytospin apparaat gebouwd en geoptimaliseerd voor gebruik met immunocytochemische kleuring. Twee celoppervlak markers (SSEA3/SSEA4) expressie werden geanalyseerd in een variant BG01 stamcellijn voor het doel van dit protocol.

Protocol

Deel 1: Vering immunocytochemische kleuringsprocedure Cellen worden geoogst in een enkele celsuspensie. De cellen worden vervolgens overgebracht naar 1.5-2 ml microcentrifugebuizen en gecentrifugeerd bij 200g gedurende 4 minuten. Cellen worden gewassen door opzuigen uit supernatant, opnieuw gesuspendeerd in 1 ml PBS – (zonder Mg 2 + en Ca 2 +) en dan weer gecentrifugeerd bij 200g gedurende 4 minuten. Dit moet twee keer worden gedaan. Na het wassen, worden de…

Discussion

Voor de toepassing van ons lab, is een 35mm gerecht van stamcellen culturen gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) toegewezen voor de immunocytochemische kleuring procedure voor gebruik met de Cytospin apparaat. De cellen worden vervolgens verzameld door middel van enzymatische passage, het verwijderen van zoveel mogelijk van de MEF laag als mogelijk, in een single-celsuspensie. Als er meer effectiever stamcellen isolatie van de MEF laag gewenst is, kan kolonies dan handmatig worden opgehaald verteerd in suspens…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Lab Tek Permanox Chamber Slide		Thermo Fisher Scientific	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned		Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips		USA Scientific	1121-3810
Microscope Cover Glass		Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280		Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS		Gibco	14190
Normal Goat Serum		Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody		Millipore/Chemicon	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG		Invitrogen/ Molecular Probes	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride		CalBioChem	268298