Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.
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Artigo de método
Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) que incluem células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) são fontes de células emocionante devido à sua ilimitada capacidade de auto-renovação e seu potencial de se diferenciar em vários tipos de células. O estado de pluripotentes hPSCs é tipicamente avaliada por técnicas tais como qPCR, imunocitoquímica, e por outros
Protocolo
Parte 1: Coloração Suspensão imunocitoquímico
- As células são colhidas em uma suspensão de células individuais.
- As células são então transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 2mL e centrifugado a 200g por 4 minutos.
- As células são lavadas por aspiração fora sobrenadante, re-suspensas em 1mL de PBS - (sem Mg 2 + e Ca 2 +) e depois centrifugada novamente a 200g por 4 minutos. Isto deve ser feito duas vezes.
- Após a lavagem, as células são então fixado pelo re-suspendendo-as em 1mL de 4% paraformaldeído (PFA) em temperatura ambiente por 10 minutos.
- As células são lavadas novamente duas veze....
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Discussão
Para efeitos do nosso laboratório, um prato de 35 milímetros de culturas de células-tronco cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) é alocado para o procedimento de coloração imunocitoquímica para uso com o aparelho cytospin. As células são então coletados por meio de passaging enzimática, removendo o máximo da camada de MEF quanto possível, em uma suspensão de uma única célula. Se mais de isolamento de células-tronco eficaz a partir da camada MEF é desejada, as colônias podem ser manualmente escolheu entã.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Financiamento parcial para este trabalho foi fornecida pela NSF CARREIRA-0744556 (Rao) e uma bolsa de estudos através do VCU-HHMI Ciências da Educação e Programa de Pesquisa (Pascual).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâmina com Câmara Lab Tek Permanox | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 117437 | Material para lâminas plásticas reutilizadas |
| Lâminas Microscópicas Superfrost/Plus Pré-limpas | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Pontas de Filtragem de 0,1-10μL | USA Scientific, Inc. | 1121-3810 | |
| Cobreglass para Microscópio | Fisher Scientific | 120542-B | |
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Meio de Montagem |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Soro Normal de Cabra | Invitrogen | 10000C | |
| Anticorpo Monoclonal Anti-SSEA-4 de Camundongo | EMD Millipore | MAB4304 | Anticorpo Primário para Coloração de SSEA-4 |
| Anticorpo Monoclonal Anti-SSEA-3 de Rato | EMD Millipore | MAB4303 | Anticorpo Primário para Coloração de SSEA-3 |
| Alexa Fluor 488 Anti-IgG de Cabra Conjugado com Camundongo | Invitrogen | A11029 | Anticorpo Secundário para Coloração de SSEA-4 |
| Alexa Fluor 488 Anti-IgG de Cabra Conjugado e Rotulado para Rato | Invitrogen | A11006 | Anticorpo Secundário para Coloração de SSEA-3 |
| DAPI, Dicloridrato | Calbiochem | 268298 |
Referências
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (200....
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Reimpressões e permissões
