Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي
Summary
وقد تحقق تلطيخ تعليق immunocytochemical البشرية الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) عن سطح الخلية علامات (SSEA-3/SSEA-4) على أساس استخدام جهاز cytospin عصامي لإنشاء أحادي الطبقة من الخلايا للمراقبة والقياس الكمي.
Abstract
الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والبشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) هي مصادر الخلية مثيرة نظرا لقدراتها الذاتية التجديد لا حدود لها وقدرتها على التمايز إلى أنواع خلايا متعددة. عادة ما يتم تقييم حالة المحفزة للhPSCs بواسطة تقنيات مثل qPCR ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، وغيرها<em> في المختبر</em> و<em> في الجسم الحي</emاستراتيجيات التمايز> إلى أنواع خلايا متعددة. من بين هؤلاء ، وقد وضعت تقنيات immunocytochemical لتوصيف الروتينية للدولة غير متمايزة من hPSCs استنادا إلى تحليل المؤشرات الحيوية مرشح الخلايا والخلايا السطحية. نظرا لحقيقة أن تنمو hPSCs كمستعمرات ، تنشأ مشاكل في عملية التقييم الكمي والتعبير عن هذه العلامات على مستوى الخلية الفردية على أساس روتيني. تحليل التدفق الخلوي تعمل على معالجة هذه المسألة ولكنها تحتاج إلى أرقام الهواتف المحمولة واستخدام الكواشف التي لا تفضي عادة روتينية لمراقبة جودة تقييم الثقافات hPSC. وبالتالي ، فإن تطوير وسائل عملية وقابلة للتكرار في خلق عينات الخلايا المونولاير مع الحفاظ على سلامة لتقييم العلامة العديد من المزايا في مجال أبحاث الخلايا الجذعية. هذا التحليل immunocytochemical تفيد كثيرا لأنه يمكن من الخلايا الفردية المونولاير ملاحظتها بسهولة وكميا للتعبير عن علامات معينة. لتحقيق هذا الهدف ، تم إنشاء جهاز cytospin عصامي والأمثل للاستخدام مع تلوين immunocytochemical. وقد تم تحليل اثنين من سطح الخلية علامات (SSEA3/SSEA4) التعبير في خط BG01 البديل الخلايا الجذعية لأغراض هذا البروتوكول.
Protocol
Discussion
لأغراض مختبرنا ، يتم تخصيص طبق 35mm الثقافات الخلايا الجذعية الجنينية المزروعة في الخلايا الليفية الماوس (MEFs) لإجراء تلطيخ immunocytochemical للاستخدام مع جهاز cytospin. ثم يتم جمع الخلايا من خلال الركض الأنزيمية ، وإزالة أكبر قدر من طبقة MEF ممكن ، في تعليق وحيد الخلية. إذا كان المط?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل الجزئي لهذا العمل من قبل قوات الامن الوطني وظائف 0744556 (راو) وعلى منحة دراسية من خلال تعليم العلوم ، جامعة فرجينيا كومنولث HHMI وبرنامج البحث (باسكوال).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 117437 | Material for re-used plastic slides | |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | ||
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific | 1121-3810 | ||
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | ||
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium | |
| DPBS | Gibco | 14190 | ||
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | ||
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | Millipore/Chemicon | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining | |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen/ Molecular Probes | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining | |
| DAPI, Dihydrochloride | CalBioChem | 268298 |
Referências
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. – Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
