後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

Summary

このビデオでは、後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、フラ-2を使用してカルシウム濃度の神経突起伸長とイメージングを示す。

Abstract

このビデオでは、我々は後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。手順は蛹殻形成後70〜78時間で動物からの脳の除去から始まります。分離された脳は、無血清増殖培地で数回の洗浄に続いて、パパインで短いインキュベーションの後に表示されます。カバースリップ上のメディアの5μlのドロップで各脳の機械的解離のプロセスが図示されている。有糸分裂後のニューロンの軸索と樹状突起は、解離中に相馬の近くにオフsheeredしかしニューロンは、メッキの数時間内のプロセスを再生成を開始されています。画像は2日間でライブの文化を示しています。神経細胞は、培養中の最初の週の間にプロセスを詳しく説明し続ける。特定の神経集団は、GFPやRFPなどの蛍光マーカーの組織特異的発現を駆動するためにGAL4ラインを使用して文化の中で識別することができます。全セルの録音は、機能的、自発的にアクティブなコリン作動性およびGABA作動性シナプスを形成する培養神経細胞を実証している。短いビデオセグメントは、培養神経細胞の皿で自発的カルシウムトランジェントとニコチン誘発カルシウム応答を監視するためにカルシウム指示薬としてフラ-2を用いて培養神経細胞でのカルシウム動態を示しています。これらの蛹の脳の文化は遺伝的および薬理学的ツールは、中央のシナプスの形成と機能に影響を与える内因性および外因性の要因を識別するために使用できる有用なモデルシステムです。

Protocol

培養の一日前の準備： 無菌解剖ソリューションとなります。 滅菌DMEMを作成し、2週間に4℃で10mlのアリコートにしてください。 1ヶ月に50または100μlアリコートで滅菌DDM2サプリメントや凍結を行います。 錯那/ラミニンください。 コー​​トのカバースリップ。 オプション：最大4ヶ月間冷凍無菌CNBMや店舗を作る。 培養の日に</p…

Discussion

彼らは神経突起を拡張し、機能的なシナプス結合を形成する場所胚/出生後のげっ歯類の脳から採取した神経細胞は初代培養細胞で増殖させることができる。これらの培養物の調製方法は十分に確立されており、げっ歯類ニューロン培養の研究は、シナプス形成と機能の調節（バンカーとゴズリン、1991）に関与する遺伝子と環境要因を特定する上で重要な役割を果たしている。様々な種から昆虫のニューロ?…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Concanavalin A		Sigma	C-2010	To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma	L-2020	Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C.

Coating Coverslips: Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish. Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip. Place in 37 C incubator for 2 hours. Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet. During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides. Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish. Store at room temperature for up to a month.