Geç Stage Drosophila pupa Brain İlköğretim Nöronal Kültürler

Summary

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme Fura-2 kullanarak kalsiyum düzeyleri neurite akıbet ve görüntüleme göstermektedir.

Abstract

Bu video, geç dönem Drosophila pupa beyinleri primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Prosedür puparium oluşumundan sonra 70-78 saat hayvanların beyinlerinin kaldırılması ile başlar. Izole beyinleri serum büyüme ortamında birkaç yıkar takip papain kısa inkübasyondan sonra gösterilmiştir. Bir lamel medya 5 ul açılan her bir beyin mekanik ayrılma süreci gösterilmektedir. Post-mitotik nöronların akson ve dendritler disosiasyon sırasında soma yakın sheered ama nöronlar kaplama bir kaç saat içinde süreçleri yeniden başlar. Görüntüler 2 gün canlı kültürler göstermektedir. Nöronlar kültüründe ilk haftasında süreçlerini ayrıntılı olarak devam etmektedir. Spesifik nöronal nüfus, kültür, GFP veya RFP floresan belirteçleri doku belirli bir ifade sürücü GAL4 hatları kullanarak tespit edilebilir. Tüm hücre kayıtları kültürlü nöronların fonksiyonel, kendiliğinden aktif ve GABAerjik kolinerjik sinaps oluşturur göstermiştir. Kısa bir video segment, kültürlü nöronların bir tabak içinde kendiliğinden kalsiyum transientler ve nikotin uyarılmış kalsiyum tepkileri izlemek için bir kalsiyum gösterge boyası olarak Fura-2 kullanarak kültürlü nöronlarda kalsiyum dinamiklerini göstermektedir. Bunlar pupa beyin kültürleri, genetik ve farmakolojik araçları merkezi sinaps oluşumu ve fonksiyonunu etkileyen iç ve dış faktörleri tanımlamak için kullanılabilecek yararlı bir model sistem.

Protocol

Kültür gün önce hazırlıklar: Steril diseksiyon çözüm olun. Steril DMEM olun ve 10 ml alikotları tutmak, 4 ° C 2 hafta boyunca. 1 ay için 50 veya 100 ul alikotları steril DDM2 takviyeleri ve donma olun. CONA / laminin olun. Kat lamelleri. İsteğe Bağlı: 4 ay kadar donmuş steril Cnbm ve mağaza olun. Kültür, günü I. laminer akış kaput Enzim Çözümü (ES) hazırlayın 5 …

Discussion

Neurites uzatmak ve fonksiyonel sinaptik bağlantıları oluşturmak embriyonik / postnatal kemirgenler beyinleri hasat nöronlar primer hücre kültürü yetiştirilebilir. Bu kültürlerin hazırlanması için Yöntemleri iyi kurulmuş ve kemirgen nöronal kültürlerin çalışmalar, sinaps oluşumu ve işlevi düzenlenmesi (Banker ve Goslin, 1991) yer alan genler ve çevresel faktörlerin belirlenmesi kritik bir rol oynamıştır. Türlerin çeşitli böcek nöron kültüründe yetişen olabilir, fonksiyonel kültür sinaptik bağlantı…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Concanavalin A		Sigma	C-2010	To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma	L-2020	Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C.

Coating Coverslips: Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish. Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip. Place in 37 C incubator for 2 hours. Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet. During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides. Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish. Store at room temperature for up to a month.