늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

Summary

이 동영상은 늦게 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 Fura – 2를 사용하여 칼슘 수준의 neurite의 파생물 및 이미징을 보여줍니다.

Abstract

이 비디오에서는, 우리는 늦은 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 절차는 번데기 형성 후 70-78 시간에 동물의 두뇌의 제거와 함께 시작됩니다. 고립된 두뇌는 혈청이없는 성장 매체에 여러 세척 다음 papain의 짧은 부화 후 표시됩니다. coverslip에 대한 미디어의 5 UL 드롭의 각 두뇌의 기계적 분리의 과정을 그림입니다. 포스트 mitotic의 뉴런의 axons과 dendrites이 분리되는 동안 소마 근처에서 털을 깎으하지만 뉴런은 도금 몇 시간 이내에 프로세스를 생성하기 시작합니다. 이미지 2 일에서 살고 문화를 보여줍니다. 뉴런은 문화의 첫 번째 주 동안 프로세스를 정교로 진행합니다. 특정의 연결 인구는 같은 GFP 또는 RFP 같은 형광 마커의 조직 구체적인 표현을 드라이브에 GAL4 라인을 사용하는 문화에서 확인할 수 있습니다. 전체 셀 녹음은 교양 뉴런은 기능, 자발적으로 적극적인 cholinergic 및 GABAergic 시냅스를 형성 증명하고있다. 짧은 비디오 세그먼트는 교양 뉴런의 접시에 자발적인 칼슘 과도 및 니코틴 evoked 칼슘 반응을 모니터하기 위해 칼슘 표시기 색소로 Fura – 2를 사용하여 교양 뉴런의 칼슘 역학을 보여줍니다. 이러한 pupal 뇌 문화 유전 및 약리 도구 중앙 시냅스 형성과 기능에 영향을 내장하고 외부 요인을 식별하는 데 사용될 수있는 유용한 모델 시스템입니다.

Protocol

culturing의 하루 전에 준비 : 멸균 해부 솔루션을 확인하십시오. 멸균 DMEM 만들기 4 10 ML aliquots에 보관 ° C를 2 주 동안. 1 개월 50 또는 100 μl aliquots에 살균 DDM2 보충 및 동결하십시오. 코나 / laminin하십시오. 외투 coverslips. 옵션 : 최대 4 개월까지 냉동 살균 CNBM하고 저장하십시오. culturing의 날에 나도 층류 흐름 후드…

Discussion

그들이 neurites을 확장하고 기능적인 시냅스 연결을 형성 어디 배아 / 출생 후의 설치류 동물의 두뇌에서 수확 뉴런은 기본 세포 배양 재배하실 수 있습니다. 이러한 문화의 준비를위한 방법은 잘 구축하고 있으며 설치류의 연결을 문화의 연구 버렸네 형성과 기능의 조절 (뱅커와 고슬린, 1991)에 관련된 유전자와 환경 요인을 식별하는 중요한 역할을했습니다. 인류의 다양한 곤충 뉴런도 문화의 성장 수 있지만, 문…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Concanavalin A		Sigma	C-2010	To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma	L-2020	Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C.

Coating Coverslips: Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish. Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip. Place in 37 C incubator for 2 hours. Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet. During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides. Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish. Store at room temperature for up to a month.