Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

Summary

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía. Puntos de vista de las culturas show en vivo de crecimiento de las neuritas y la imagen de los niveles de calcio con Fura-2.

Abstract

En este vídeo, se demuestra la preparación de cultivos primarios de neuronas del cerebro de Drosophila finales de etapa de pupas. El procedimiento comienza con la eliminación de los cerebros de los animales en 70-78 horas después de la formación pupario. Los cerebros aislados se presentan después de la incubación breve en papaína seguido de varios lavados en medio de cultivo libre de suero. El proceso de separación mecánica de cada cerebro en una caída de 5 ul de los medios de comunicación en un cubreobjetos se ilustra. Los axones y las dendritas de las neuronas post-mitóticas son sheered cuando esté cerca del soma en la disociación, pero las neuronas comienzan a regenerarse los procesos dentro de unas horas de la siembra. Las imágenes muestran las culturas en vivo en 2 días. Las neuronas continúan elaborando los procesos durante la primera semana de la cultura. Poblaciones neuronales específicas, se pueden identificar en la cultura de uso de líneas GAL4 para dirigir la expresión específica de tejido de los marcadores fluorescentes, como las buenas prácticas agrarias o RFP. Grabaciones de células enteras han demostrado los cultivos de neuronas forman sinapsis funcionales, colinérgicas y GABAérgicas espontáneamente activo. Un segmento corto video ilustra la dinámica del calcio en las neuronas cultivadas con Fura-2 como un tinte indicador de calcio para controlar los transitorios espontánea de calcio y la nicotina respuestas evocadas de calcio en un plato de neuronas cultivadas. Estas culturas el cerebro de pupa son un modelo útil en el que las herramientas genéticas y farmacológicas se puede utilizar para identificar los factores intrínsecos y extrínsecos que influyen en la formación y función de las sinapsis centrales.

Protocol

Los preparativos antes del día de cultivo: Hacer una solución estéril de disección. Hacer estéril DMEM y mantenerse en alícuotas de 10 ml a 4 º C durante 2 semanas. Hacer estéril DDM2 suplementos y congelar en 50 o 100 alícuotas de 1 mes. Hacer ConA / laminina. Cubreobjetos de abrigo. Opcional: Haga CNBM estéril y guardar congelado hasta por 4 meses. En el día de cultivo I. Preparar la solució…

Discussion

Las neuronas cosecha de los cerebros de los roedores embrionarias / postnatal se puede cultivar en cultivo de células primarias, donde se extienden neuritas y la forma funcional de conexiones sinápticas. Métodos para la preparación de estas culturas están bien establecidos y los estudios en cultivos de neuronas de roedores han jugado un papel fundamental en la identificación de genes y factores ambientales implicados en la regulación de la formación de sinapsis y la función (Banker y Goslin, 1991). Mientras que las neuronas de inse…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Concanavalin A		Sigma	C-2010	To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma	L-2020	Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C.

Coating Coverslips: Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish. Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip. Place in 37 C incubator for 2 hours. Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet. During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides. Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish. Store at room temperature for up to a month.