Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

Summary

Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Neuritenwachstum und Bildgebung von Calcium-Spiegel mit Fura-2.

Abstract

In diesem Video zeigen wir die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Das Verfahren beginnt mit der Entfernung der Gehirne von Tieren, bei 70-78 Std. nach Puparium Bildung. Die isolierte Gehirne sind nach kurzer Inkubationszeit in Papain von mehreren Wäschen in serumfreien Wachstumsmedium gefolgt gezeigt. Der Prozess der mechanischen Dissoziation jedes Gehirn in einem 5-ul Tropfen Medien auf einem Deckglas dargestellt. Die Axone und Dendriten der post-mitotischen Neuronen off in der Nähe des Soma während Dissoziation sheered aber die Neuronen beginnen, um Prozesse innerhalb von wenigen Stunden plating regenerieren. Bilder zeigen, lebende Kulturen in 2 Tagen. Neuronen weiterhin Prozesse während der ersten Woche in Kultur zu erarbeiten. Speziellen neuronalen Populationen können in Kultur identifiziert werden mit GAL4 Linien gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Markern wie GFP oder RFP-Laufwerk. Ganzzell-Aufnahmen haben gezeigt, den kultivierten Neuronen bilden funktionelle, spontan aktive cholinergen und GABAergen Synapsen. Ein kurzes Video Segment zeigt Calcium-Dynamik in der kultivierten Neuronen mit Fura-2 als Kalzium-Indikator-Farbstoff zu spontanen Kalzium Transienten und Nikotin hervorgerufenen Calcium-Reaktionen in eine Schüssel mit kultivierten Neuronen zu überwachen. Diese Puppen Gehirn Kulturen sind ein nützliches Modell, bei dem genetische und pharmakologische Werkzeuge zur inneren und äußeren Faktoren, die Bildung und Funktion von zentralen Synapsen beeinflussen identifiziert werden können.

Protocol

Vorbereitungen vor dem Tag der Kultivierung: Machen Sie sterile Sezieren Lösung. Machen Sie sterile DMEM und behalten in 10 ml Aliquots bei 4 ° C für 2 Wochen. Machen Sie sterile DDM2 Ergänzungen und frieren in 50 oder 100 ul Aliquots für 1 Monat. Machen ConA / Laminin. Coat Deckgläser. Optional: Stellen sterile CNBM und Speicher für bis zu 4 Monate eingefroren. Am Tag der Kultivierung I. Vorbereit…

Discussion

Neuronen aus dem Gehirn von embryonalen / postnatale Nagetiere geerntet werden in primären Zellkulturen gezüchtet werden, wo sie Neuriten und erweitern Form funktioneller synaptischer Verbindungen. Methoden zur Herstellung dieser Kulturen sind gut etabliert und Studien in Nagetieren neuronalen Kulturen haben eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Genen und Umweltfaktoren bei der Regulierung der Synapsenbildung und Funktion (Banker und Goslin, 1991) beteiligt gespielt. Während Insekten Neuronen aus einer Vielzahl von Arten k…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Concanavalin A		Sigma	C-2010	To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma	L-2020	Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C.

Coating Coverslips: Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish. Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip. Place in 37 C incubator for 2 hours. Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet. During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides. Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish. Store at room temperature for up to a month.