Culture primarie neuronale dal cervello di tardo fase Drosophila Pupae

Summary

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. Visto di culture live show crescita dei neuriti e l'imaging di livelli di calcio con Fura-2.

Abstract

In questo video, dimostriamo la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. La procedura inizia con la rimozione di cervelli di animali a 70-78 ore dopo la formazione puparium. I cervelli isolati sono mostrati dopo incubazione breve papaina seguito da numerosi lavaggi in mezzo privo di siero di crescita. Il processo di dissociazione meccanica di ogni cervello in un calo del 5 ul di media su un vetrino è illustrato. Gli assoni e dendriti del post-mitotico neuroni sono sheered in prossimità del soma durante dissociazione, ma i neuroni cominciano a rigenerare i processi in poche ore di placcatura. Immagini mostrano fermenti vivi a 2 giorni. I neuroni continuano a elaborare processi durante la prima settimana della cultura. Specifiche popolazioni di neuroni possono essere identificati in coltura utilizzando GAL4 linee per guidare l'espressione di marcatori specifici del tessuto fluorescente come GFP o RFP. Registrazioni di cellule intere hanno dimostrato l'neuroni coltivati ​​forma funzionale, sinapsi colinergica attiva spontaneamente e GABAergici. Un segmento breve video che illustra le dinamiche del calcio nei neuroni in coltura con Fura-2 come un colorante indicatore di calcio di monitorare transienti di calcio spontanea e nicotina risposte di calcio evocate in un piatto di neuroni in coltura. Queste culture cervello pupa sono un sistema modello utile in cui gli strumenti genetica e farmacologica può essere utilizzato per identificare i fattori intrinseci ed estrinseci che influenzano la formazione e la funzione delle sinapsi centrale.

Protocol

I preparativi prima del giorno di coltura: Fai la soluzione sterile dissezione. Rendere sterile DMEM e mantenere in aliquote da 10 ml a 4 ° C per 2 settimane. Rendere sterile DDM2 integratori e congelare in 50 o aliquote di 100 microlitri per 1 mese. Fai ConA / laminina. Cappotto coprioggetto. Opzionale: Fai CNBM sterile e conservare congelati per un massimo di 4 mesi. Il giorno di coltura I. Preparare s…

Discussion

I neuroni raccolte dal cervello di roditori embrionale / postnatale possono essere coltivate in coltura cellulare primaria dove si estendono neuriti e la forma funzionale connessioni sinaptiche. Metodi per la preparazione di queste culture sono ben stabiliti e gli studi in colture neuronali roditori hanno svolto un ruolo fondamentale per identificare geni e fattori ambientali coinvolti nella regolazione della formazione di sinapsi e la funzione (Banker e Goslin, 1991). Mentre i neuroni degli insetti da una varietà di specie possono essere …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Concanavalin A		Sigma	C-2010	To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma	L-2020	Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C.

Coating Coverslips: Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish. Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip. Place in 37 C incubator for 2 hours. Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet. During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides. Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish. Store at room temperature for up to a month.