Primär Neuronal kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor

Summary

Denna video visar förberedelserna primära neuronala kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor. Utsikt över levande kulturer visar neurite utväxt och avbildning av kalcium nivåer med Fura-2.

Abstract

I denna video visar vi utarbetandet av primära neuronala kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor. Proceduren börjar med avlägsnandet av hjärnor från djur på 70-78 timmar efter puparium bildas. De isolerade hjärna visas efter kort inkubationstid på papain följts av flera tvättar i serum-fri tillväxt medium. Processen för mekaniska dissociation av varje hjärnan i ett 5 ul droppe media på ett täckglas illustreras. Den axoner och dendriter av post-mitotiska nervceller girade av nära Soma under dissociation men nervceller börja återskapa processer inom några timmar bordläggningen. Bilderna visar levande kulturer på 2 dagar. Nervceller fortsätta att utveckla processer under den första veckan i kulturen. Särskilda neuronala populationer kan identifieras i kulturen med hjälp av GAL4 linjer att köra vävnad specifikt uttryck av fluorescerande markörer som GFP eller offertförfrågan. Helcells inspelningar har visat på odlade nervceller bildar funktionella, spontant aktiva kolinerga och GABAergic synapser. En kort video segment illustrerar kalcium dynamiken i odlade nervceller med Fura-2 som en kalcium indikator färgämne för att övervaka spontana kalcium transienter och nikotin evoked potential kalcium i ett fat med odlade nervceller. Dessa PUPP-hjärnan kulturer är en användbar modell system där genetiska och farmakologiska verktyg kan användas för att identifiera endogena och exogena faktorer som påverkar bildningen och funktionen av centrala synapser.

Protocol

Förberedelser inför dagen i odling: Gör steril dissekera lösning. Gör sterila DMEM och hålla i 10 ml alikvoter vid 4 ° C i 2 veckor. Gör sterila DDM2 kosttillskott och frysa i 50 eller 100 l alikvoter i 1 månad. Gör Cona / laminin. Coat täckglas. Tillval: Gör sterila CNBM och lagra frysta upp till 4 månader. På dagen i odling I. Förbered Enzyme Solution (ES) i laminärt flöde huva …

Discussion

Nervceller skördas från hjärnan hos embryonala / postnatala gnagare kan odlas i primär cell kultur där de sträcker neurites och bildar funktionella synapsförbindelser. Metoder för beredning av dessa kulturer är väl etablerade och studier i gnagare neuronala kulturer har spelat en avgörande roll i att identifiera gener och miljöfaktorer är inblandade i regleringen av synaps bildning och funktion (Banker och Goslin, 1991). Medan insekt nervceller från en mängd olika arter kan också odlas i kultur, den enda insekt nervceller vi…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Concanavalin A		Sigma	C-2010	To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Laminin		Sigma	L-2020	Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months.
Coverslips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	12 mm glass coverslips
ConA + Laminin solution				Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Dissecting Solution	Buffer			For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C.
Solution B: HEPES	Buffer	Sigma	H-3375	20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C.
Solution A	Buffer			For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C.

Coating Coverslips: Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish. Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip. Place in 37 C incubator for 2 hours. Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet. During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides. Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish. Store at room temperature for up to a month.