Summary
Questo lavoro descrive l'uso di un metodo di galleggiamento per identificare Toxocara canis e Ancylostoma spp. rilevati in campioni fecali raccolti da cani in Messico dal 2017 al 2021 in condizioni di campo.
Abstract
La diagnosi di parassiti canini con potenziale zoonotico come Toxocara canis e Ancylostoma caninum in condizioni di campo è solitamente difficile a causa dell'accesso limitato a un laboratorio nelle aree rurali e suburbane del Messico. Questo studio mirava a rilevare T. canis e Ancylostoma spp. in campioni fecali raccolti da cani in Messico dal 2017 al 2021 in condizioni di campo. Il calcolo della dimensione del campione ha portato a un obiettivo di arruolamento di 534 cani in tutto il paese.
I campioni sono stati raccolti direttamente dal retto o dal terreno dopo la defecazione. I campioni sono stati conservati in sacchetti di plastica individuali ben sigillati a 4 °C. Una soluzione satura di cloruro di sodio (peso specifico [SpG] 1,20) è stata preparata sia in condizioni di campo che di laboratorio. Entro 3 giorni dalla raccolta, 2-4 g di feci sono stati testati per i parassiti utilizzando un metodo di flottazione sospendendo ogni campione fecale in una soluzione salina. Le feci sono state mescolate con la soluzione di flottazione e frantumate con un cucchiaio di metallo.
Una volta ottenuta una consistenza uniforme, il campione fecale è stato versato in un nuovo bicchiere di plastica utilizzando un setaccio e lasciato riposare per 10-15 minuti. Tre gocce dalla parte superiore della miscela sono state raccolte utilizzando un ciclo di inoculazione sterilizzato. I vetrini sono stati posizionati al microscopio e i parassiti sono stati identificati da parassitologi addestrati. I campioni fecali di 1.055 cani sono stati sottoposti a screening microscopico. Il numero di campioni positivi per Ancylostoma spp. è stato di 833 (frequenza del 78,95%) e di 222 (21,04%) per T. canis. Questi risultati illustrano l'importanza di identificare gli elminti zoonotici nei cani che vivono in aree urbane e rurali in Messico utilizzando una tecnica coproparassitoscopica in laboratorio e in condizioni di campo.
Introduction
I parassiti gastrointestinali sono uno dei problemi di salute più comuni che colpiscono i cani1. Le stime suggeriscono che ci sono ~ 700 milioni di cani domestici in tutto il mondo e circa 175 milioni possono essere classificati come free-roaming2. Più di 60 specie di parassiti sono condivise tra cani ed esseri umani, suggerendo che i cani potrebbero essere una fonte di infezione per gli esseri umani con questi parassiti3. Toxocara canis e Ancylostoma caninum sono due specie parassitarie che infettano i cani e, accidentalmente, gli ospiti umani. Attualmente, ci sono diversi studi sui luoghi in cui questi elminti sono in grado di sopravvivere e riprodursi in Messico. La prevalenza di Toxocara nei cani varia dallo 0% a oltre l'87% negli Stati Uniti, in Messico, in America Centrale e nei Caraibi4. Toxocara canis e Ancylostoma spp., così come altre specie parassitarie nei cani, sono state precedentemente segnalate in Messico 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabella 1).
| Specie parassite | Regione | Prevalenza (%) | Riferimento |
| Ancylostoma caninum | cantone di Querétaro | 42.90 | 5 |
| Tabasco | 15.90 | 6 | |
| Campeche | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| Yucatán | 73.8 | 8 | |
| Babesia | Morelos | 13.60 | 9 |
| Veracruz | 10.00 | ||
| Oocisti cocciidee | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Ctenocefaluridi | Morelos | 30.3 | 10 |
| Caninum di Dipylidium | Yucatán | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | Yucatán | 7.0 – 8.3 | 11 |
| Giardia | Tabasco | 3.00 | 6 |
| Yucatán | 18.8 | 8 | |
| Leishmania | Chiapas | 19.00 | 12 |
| Tenie | Bassa California | 6.79 | 13 |
| Canis di Toxocara | cantone di Querétaro | 22.10 | 5 |
| Yucatán | 6.20 | 8 | |
| Vulpis di Trichuris | Yucatán | 25.40 | 8 |
| Trypanosoma | Jalisco | 8.10 | 9 |
| Campeche | 7.60 | ||
| Chiapas | 4.5 – 42.8 | ||
| Quintana Roo | 20.1 – 21.3 | ||
| Toluca | 17.50 | ||
| Yucatán | 9.8 – 34 |
Tabella 1: Prevalenza regionale (%) dei parassiti del cane in Messico dal 2001 al 2020. I risultati di precedenti indagini condotte dal 2001 al 2020 hanno permesso di identificare la distribuzione dei parassiti canini in diversi contesti urbani e rurali in Messico. Questi studi forniscono una profonda comprensione degli elementi epidemiologici che favoriscono la persistenza dei parassiti canini in diversi ecosistemi, contribuendo a una valutazione completa dell'impatto zoonotico di alcune specie di parassiti.
Le fasi del ciclo di vita dei parassiti intestinali, come uova, cisti, oocisti o larve, possono essere trovate in campioni di feci. Pertanto, l'esame del materiale fecale fornisce informazioni preziose sui parassiti di un animale. La necessità di un metodo per rilevare le uova di Ancylostomidae nelle feci umane ha portato all'uso del semplice striscio fecale nel 1878, che è stato utilizzato per molti anni per rilevare i parassiti gastrointestinali ma è stato considerato poco sensibile. Da qui è emersa la necessità di sviluppare metodi copromicroscopici migliori14. Sono passati più di 100 anni da quando è stata descritta per la prima volta la tecnica di flottazione per il recupero e il conteggio delle uova di parassita nei campioni fecali15. Da allora, diversi metodi e varianti della tecnica di flottazione sono stati considerati uno standard per il rilevamento di alcuni parassiti nei loro ospiti.
Ad esempio, Lane descrisse un metodo nel 1924 che coinvolgeva la tecnica di flottazione centrifuga diretta, che integra la centrifugazione seguita dal galleggiamento del sedimento in una soluzione satura di cloruro di sodio con SpG 1,2 in 1 g (Lane) o 10 g (modifica di Stoll). La tecnica di flottazione è stata successivamente modificata utilizzando soluzioni con diversi SpG14. Nel 1939, Gordon e Whitlock riportarono gli svantaggi della tecnica di Stoll a causa dell'interferenza dei detriti nella visualizzazione delle uova del parassita e svilupparono il metodo quantitativo noto come McMaster16. Nel 1979, O'Grady e Slocombe dimostrarono che il peso specifico della soluzione, la tempistica e le dimensioni delle maglie dei filtri influenzano l'accuratezza del rilevamento delle uova utilizzando la tecnica di flottazione17. Negli ultimi decenni, poiché sono state apportate diverse modifiche alla tecnica di flottazione, c'è un urgente bisogno di standardizzare i metodi di flottazione. Attualmente, il rilevamento delle infezioni da elminti canini nel contesto della prevenzione dei parassiti zoonotici è necessario per applicare trattamenti antielmintici appropriati per limitare la contaminazione ambientale con stadi infettivi di nematodi zoonotici18.
Tra i metodi qualitativi, la tecnica di flottazione fecale è ampiamente utilizzata e accettata perché non richiede molta attrezzatura, è semplice, economica e riproducibile; Tuttavia, ha un grosso svantaggio in quanto manca di sensibilità quando l'intensità dell'infezione è bassa19. La capacità di rivelare la presenza di un maggior numero di elementi parassiti come uova, oocisti, cisti o larve di nematodi è solitamente determinata dalla densità della soluzione20.
Rapporti precedenti hanno confrontato le tecniche coproparassitologiche per il rilevamento delle uova di nematodi canini. Per quanto riguarda l'individuazione dei protozoi mobili, si ricorre a strisci fecali diretti; mentre i metodi di sedimentazione sono utili per diagnosticare uova pesanti di parassiti come i trematodi21. Uno dei test diagnostici sul campo più utilizzati è il metodo dello striscio fecale. Tuttavia, il basso livello di sensibilità di questa tecnica può essere attribuito al fatto che contiene detriti che interferiscono con il rilevamento delle uova del parassita. Incorporando una fase di setacciatura insieme a soluzioni che forniscono il corretto SpG, il metodo di flottazione offre un'osservazione più chiara e meno ingombrante delle uova di ascaridi e anchilostomi. Ciò porta a un processo più preciso ed efficiente per lo screening microscopico22. Allo stesso modo, le tecniche di flottazione semplice e centrifuga diretta sono molto comunemente utilizzate per recuperare uova e oocisti parassite14. I metodi di flottazione classici possono essere considerati qualitativi o quantitativi a seconda dell'utilizzo di una camera di conteggio come il metodo McMaster15. Tuttavia, poiché la tecnica di flottazione ha una bassa sensibilità e si concentra sull'individuazione di parassiti nel periodo di brevetto, i risultati negativi non dovrebbero essere considerati conclusivi. Tuttavia, l'accuratezza non dipende solo dalla procedura di conservazione dei campioni fecali o dalla SpG delle soluzioni di flottazione, ma dipende anche dalla competenza tecnica e dall'esperienza nell'esecuzione di esami fecali dell'utente.
Di conseguenza, sono stati esplorati altri metodi per il rilevamento di parassiti canini nelle feci. È stato generalmente riconosciuto che uno degli approcci più utilizzati per la diagnosi delle infezioni intestinali da elminti nei cani è la tecnica FLOTAC, un metodo polivalente, sensibile e accurato che fornisce risultati accurati e affidabili per la diagnosi di A. caninum nei cani rispetto a un protocollo di galleggiamento in provetta e alla tecnica McMaster19, 23. I metodi di sedimentazione sono utili per recuperare le uova di trematode, le uova di nematodi embrionati e la maggior parte delle uova di tenia, che non possono essere recuperate sulla superficie di una soluzione di flottazione perché queste strutture non galleggiano24. Un metodo che si è dimostrato superiore alle tecniche di flottazione/sedimentazione è il metodo di flottazione a doppia centrifuga modificata, in quanto consente di rilevare le uova di cestodi nelle feci, è meno dispendioso in termini di tempo, separa le uova di Anoplocephala dai detriti fecali e riduce la cristallizzazione25. Inoltre, questa tecnica è stata utilizzata con successo per rilevare uova ascaridi con elevata sensibilità26. Tuttavia, alcune di queste tecniche e metodi centrifughi come l'Ovassay, al contrario del protocollo di flottazione che proponiamo in questo studio, richiedono la conservazione del campione in reagenti come la formalina, kit commerciali, l'elaborazione del campione in condizioni di laboratorio e l'uso di reagenti come il solfato di zinco27 che sono costosi e richiedono speciali procedure di smaltimento per evitare la tossicità ambientale.
Recentemente è stato favorito l'uso di tecniche che aumentano la sensibilità del metodo di flottazione aggiungendo soluzioni ad alto SpG. Tuttavia, bisogna considerare che lo svantaggio di queste soluzioni è l'aumento dei detriti nella preparazione finale e quindi il rilevamento impreciso delle uova del parassita. Inoltre, la disponibilità commerciale di materiali, reagenti, costi, problemi di impatto ambientale e difficoltà di utilizzo dei metodi centrifughi influenzano la selezione di una tecnica di flottazione14, che può essere impegnativa in condizioni di campo in contrasto con il protocollo che presentiamo in questo lavoro. La preparazione delle soluzioni di flottazione con sale da cucina è vantaggiosa rispetto all'utilizzo dello zucchero perché in condizioni di campo, lo zucchero attira insetti come vespe e api e le preparazioni diventano appiccicose. Inoltre, soluzioni come il fenolo, che viene aggiunto alle soluzioni zuccherine per evitare l'appiccicosità, o lo ZnSO4sono complesse da scartare correttamente secondo le linee guida sulla protezione ambientale e non possono essere smaltite sul campo; a differenza di una soluzione di sale da cucina.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di dimostrare i passaggi per rilevare le uova di T. canis e Ancylostoma spp. in campioni fecali utilizzando un adattamento della tecnica di flottazione semplice in condizioni di campo e di laboratorio. Seguendo il protocollo qui descritto e utilizzando un microscopio con una batteria di riserva, la diagnosi di questi parassiti zoonotici canini nelle aree rurali e suburbane è possibile quando non sono disponibili attrezzature e infrastrutture di laboratorio. Il semplice metodo di flottazione descritto in questo lavoro può fornire risultati rapidi ed è una tecnica non invasiva ed economica per lo screening di routine.
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Protocol
L'uso e la cura dei cani è stato approvato dall'Università Nazionale e Autonoma del Messico.
1. Raccolta di campioni fecali
NOTA: Maneggiare il cane con l'aiuto di un veterinario o del proprietario dell'animale.
- Nel caso di cani selvatici (Figura 1A) o animali nervosi, raccogliere campioni da terra subito dopo la defecazione o non più di 10 minuti dopo.
- Lubrificare i guanti chirurgici o i sacchetti di polietilene a parete sottile con acqua o vaselina. Per raccogliere campioni fecali dal retto, indossare guanti chirurgici o sacchetti di polietilene a parete sottile.
- Raccogli almeno 2 g di feci da ogni cane (Figura 1B).
- Identifica i singoli campioni fecali come segue: data, posizione (coordinate GPS (Global Positioning System) utilizzando Google Maps), assegna un numero di identificazione per ogni animale, età approssimativa del cane, sesso del cane, razza, cane da interno o da esterno (selvatico).
- Chiudere le sacche contenenti il campione fecale con un nodo stretto. Conservare le sacche in frigorifero (4-8 °C) se i campioni di feci non vengono analizzati entro 3-4 ore dalla raccolta.
2. Preparazione di una soluzione salina satura per la diagnosi in campo
NOTA: Se l'accesso a una bilancia, a un materiale di misurazione, a fornelli o a gas per far bollire l'acqua è assente o limitato, la soluzione salina satura può essere facilmente preparata utilizzando acqua, sale da cucina comune, una tazza di plastica da 12 once (355 ml) e una bottiglia vuota di plastica soda da 1 litro.
- Lavare accuratamente una bottiglia di soda vuota da 1 L. Riempi la bottiglia con 1 L d'acqua.
- Riempi un bicchiere di plastica da 12 once con sale da cucina comune.
- Trasferisci il sale nella bottiglia di soda.
- Chiudere bene la bottiglia di soda con il tappo a vite. Agitare energicamente la soluzione fino a quando il sale non si scioglie più.
NOTA: Agitare la soluzione nella bottiglia di soda fino alla completa dissoluzione del sale può richiedere fino a 90 minuti.
3. Preparazione di una soluzione salina satura per la diagnosi di laboratorio
- Pesare 420 g di sale da cucina.
- Sciogliere 420 g di sale in 1 L di acqua.
- Far bollire la soluzione fino a quando non si scioglie più il sale.
- Filtrare la soluzione per eliminare il sale non disciolto.
- Controllare la concentrazione della soluzione utilizzando un idrometro per fluidi pesanti o un densitometro.
NOTA: La concentrazione ideale ha un SpG di 1,20 per ottenere risultati migliori (Figura 2A). La capacità di galleggiamento di un uovo è influenzata dalla sua interazione con la soluzione, contribuendo alla diversa capacità delle uova di galleggiare in soluzioni con lo stesso peso specifico. Pertanto, per ottenere un recupero ottimale delle uova, è essenziale considerare l'intervallo superiore di peso specifico nella soluzione di flottazione, assicurandosi che superi quello degli elementi parassiti bersaglio6.
4. Metodo di flottazione
NOTA: Se i campioni fecali sono troppo secchi o duri, macerarli in un mortaio.
- Usando un cucchiaio, metti circa 3 g di feci in un bicchiere di plastica (~8,5 cm di altezza e ~5,5 cm di diametro).
- Aggiungere 1 mL della soluzione salina satura fino ad ottenere una pasta.
- Mescolare per 1 minuto e aggiungere 100 ml di soluzione salina satura.
- Passare questa sospensione attraverso un colino di plastica in un secondo bicchiere di plastica per evitare particelle grossolane (Figura 2B).
- Lasciare riposare la sospensione per 15-20 minuti.
- Posizionare un'ansa di inoculazione in una fiamma per 1 s per assicurarsi che sia priva di uova, cisti o oocisti (Figura 2C).
- Attendere 5 secondi affinché il circuito di inoculazione si raffreddi (Figura 2D).
- Prelevare tre gocce dalla superficie della sospensione con l'ansa di inoculazione. Posizionare ciascuna delle tre gocce separatamente su un vetrino (Figura 2E-G)
NOTA: Assicurarsi che le gocce non siano a contatto tra loro (Figura 2H). - Osservare al microscopio con un obiettivo 10x (Figura 2I). Posizionare un vetrino coprioggetto se l'ingrandimento è aumentato a 40x.
- Quando si osserva un risultato positivo nella gocciolina, assegnare una croce (+) nel registro di laboratorio per registrare la presenza di parassiti nel periodo di brevetto in siti casuali della superficie di sospensione fecale.
5. Interpretazione del metodo di flottazione
NOTA: I risultati negativi sono inconcludenti.
- Eseguire una serie di tre test con campioni di 3 giorni consecutivi per aumentare la sensibilità del test.
NOTA: I risultati positivi indicano la presenza di parassiti nel periodo di brevetto.
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Representative Results
In questo lavoro vengono descritte le procedure di raccolta e coproparassitoscopiche per l'identificazione di T. canis e Ancylostoma spp. La logica alla base dell'adattamento del semplice metodo di flottazione fecale per rilevare le uova di elminti canini è che questa tecnica è conveniente in quanto le soluzioni, le attrezzature e i materiali sono poco costosi. Pertanto, il metodo ha un'elevata capacità di gestione dei campioni in quanto è possibile processare più campioni in un breve periodo. Inoltre, il semplice metodo di galleggiamento fecale è facile da eseguire e relativamente sensibile.
La dimensione del campione e la scelta degli animali sono state fatte in base alla convenienza determinata principalmente dalla volontà del proprietario degli animali e dalla sicurezza dei cani selvatici in avvicinamento. Nel presente lavoro, il metodo di flottazione è stato utilizzato per valutare le occorrenze e le frequenze di Ancylostoma spp. e T. canis nei cani Canis lupus familiaris in Messico per 4 anni a partire dal 2017. I campioni fecali di 1.638 cani sono stati raccolti e sottoposti a screening microscopico. Un totale di 1.235 cani sono risultati positivi per T. canis e Ancylostoma spp. Uno degli obiettivi dell'impiego del metodo di flottazione era quello di dimostrare la sua efficacia nel misurare l'insorgenza di Toxocara o Ancylostoma, ma miravamo anche a condurre un esame più approfondito dei fattori che potrebbero influire sulla loro prevalenza. Di conseguenza, sono stati scartati 185 animali con infezioni miste. Il numero di campioni positivi per Ancylostoma spp. è stato di 833 (frequenza del 78,95%) e di 222 (21,04%) per T. canis. Dei 1.050 campioni, il 75,5% (793 campioni) è stato processato e letto in un ambiente di campo preparando la soluzione di flottazione con una bottiglia di soda e utilizzando un microscopio con 3 batterie ricaricabili AA da 1,2 V per 4 ore di funzionamento continuo. I restanti 257 campioni fecali sono stati esaminati in laboratorio.
Uno degli obiettivi di questo studio è stato quello di utilizzare una soluzione di flottazione e un metodo in un ambiente di campo per accelerare e facilitare la diagnosi di due parassiti elminti dei cani in aree in cui non sono disponibili infrastrutture o attrezzature di laboratorio. L'applicazione sul campo del metodo di flottazione ci ha permesso di comunicare i risultati a 400 proprietari immediatamente dopo ogni lettura microscopica per fornire raccomandazioni sui trattamenti antielmintici e sulle misure preventive e, quindi, evitare la diffusione del parassita nell'uomo o negli animali da compagnia. Allo stesso modo, la tecnica di galleggiamento in campo ha permesso di esaminare i cani selvatici e di fornire loro un trattamento antielmintico con dolcetti o cibo. La Figura 3A e la Figura 3B mostrano le uova di T. canis e Ancylostoma spp., rispettivamente, osservate dopo che la soluzione e la tecnica di flottazione sono state eseguite in un ambiente di campo. Quando i campioni di feci fresche sono stati sottoposti al metodo di flottazione in un ambiente di campo, la soluzione preparata in una bottiglia di soda era in grado di portare le uova di elminti in flottazione. La produzione di cristalli di sale e bolle d'aria è stata confrontata con i campioni letti in un ambiente di laboratorio e l'operatore non ha rilevato alcuna differenza. Questa osservazione è incoraggiante e mette in discussione la consapevolezza che la concentrazione dei campioni fecali garantisce una lettura microscopica più accurata.
Quando la soluzione di flottazione e i campioni di feci sono stati processati in un ambiente di laboratorio, non è stata percepita alcuna differenza per quanto riguarda la morfologia e la chiarezza delle letture al microscopio, poiché la stessa quantità di detriti galleggiava contemporaneamente sia nel campo che nel laboratorio di rilevamento copromicroscopico dei parassiti. La Figura 3A,B mostra le uova di T. canis e Ancylostoma spp., rispettivamente, recuperate dai 257 campioni che sono stati processati in un laboratorio completamente attrezzato dopo il trasporto di campioni da aree urbane, suburbane e rurali. Queste uova di parassiti non differivano morfologicamente da quelle osservate in condizioni di campo (Figura 3C).
Questo protocollo ha generato un numero sufficiente di risultati per valutare l'influenza della posizione, della stagione dell'anno, del sesso, della razza, dell'età e delle condizioni esterne o interne nella prevalenza di T. canis e Ancylostoma spp. I dati di prevalenza sono stati confrontati utilizzando il test ANOVA con un valore di significatività di 0,05. La Tabella 2 mostra che T. canis ha mostrato una frequenza di distribuzione significativamente più elevata nei climi temperati e secchi rispetto agli stati caratterizzati da climi caldi, mentre non c'è stata alcuna variazione notevole nella prevalenza di Ancylostoma spp. nelle regioni con climi caldi, temperati o secchi predominanti. Allo stesso modo, Ancylostoma spp. e T. canis sono più comunemente rilevati in estate. È stato riscontrato che il 60,86% dei maschi era positivo per l'ancylostomiasi e il 37,38% per la toxocariasi. Inoltre, T. canis è stato rilevato più frequentemente nei cuccioli di età inferiore ai 6 mesi; mentre l'Ancylostoma spp. è stato più diagnosticato nei cani adulti. È interessante notare che non è stata trovata alcuna differenza tra le razze canine. L'anchilostoma del cane ha infettato il 65,54% dei cani che vivono all'aperto; tuttavia, T. canis è stato ugualmente rilevato in cani con uno stato all'aperto o al chiuso.
Figura 1: Raccolta di campioni di feci dai cani. (A) Prestare attenzione durante la raccolta di campioni di feci da cani inselvatichiti. Quando possibile, le feci fresche devono essere raccolte e conservate in un sacchetto di plastica per la presentazione e l'analisi coproparassitoscopica in laboratorio. I campioni devono essere refrigerati a 4 °C e posti in scatole di polistirolo o buste metalliche isolate entro 24 ore dalla raccolta. (B) Tre grammi di feci sono raccomandati come standard; Quindi, 2-5 g sono ragionevoli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione di una soluzione salina satura e lavorazione della sospensione fecale per microscopia. (A) La densità ideale di una soluzione satura a base di sale deve essere superiore a 1,20. Si consiglia vivamente di controllare che non ci siano cristalli sul fondo e che la soluzione sia trasparente. (B) Facendo passare la sospensione fecale attraverso un colino di plastica si rimuovono le particelle grossolane. (C) Il circuito di inoculazione deve essere esposto a una fiamma (un bruciatore da laboratorio o un comune accendino portatile) per assicurarsi che sia privo di contaminazione. (D) Lasciare raffreddare l'ansa di inoculazione e prelevare tre gocce da siti diversi sulla superficie della sospensione. (E) Dopo aver posizionato la prima goccia sul vetrino, evitare di spostare il vetrino per ridurre la fuoriuscita della gocciolina. Il vetrino fornisce una piattaforma sottile e trasparente che consente l'osservazione dei campioni. (F) Posizionare la seconda goccia al centro del vetrino. Prelevare una seconda goccia dalla superficie della sospensione fecale aumenta la probabilità di trovare uova in una sospensione in cui le strutture parassite potrebbero essere state distribuite in modo non uniforme. (G) Posizionare la terza goccia sul vetrino. Una terza goccia dalla superficie della sospensione fecale permetterà l'osservazione di un'altra area in cui potrebbero essersi concentrate le uova galleggianti. (H) Le tre gocce vengono osservate separatamente sul vetrino per rilevare le uova di nematodi da diverse aree della superficie della sospensione fecale. (I) Osservare il campione al microscopio utilizzando l'obiettivo 10x. Se l'obiettivo viene modificato a 40x, posizionare un vetrino coprioggetto sulle goccioline di sospensione fecale. Quando si osserva un risultato positivo nella gocciolina, assegnare una croce (+) per contrassegnare la presenza di parassiti nel periodo di permanenza in siti casuali della superficie di sospensione fecale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Uova di Toxocara canis e Ancylostoma spp. rilevate al microscopio ottico con ingrandimento 40x. (A) Uova di Toxocara canis rilevate al microscopio ottico con ingrandimento 40x. Il metodo di flottazione ha permesso la visualizzazione di campi microscopici puliti e privi di materiali grossolani (raccolti in un ambiente di campo). Indipendentemente dal metodo di preparazione della soluzione di flottazione, le uova erano visibili e osservate principalmente senza alterazioni morfologiche. (B) Uova di Ancylostoma spp. rilevate al microscopio ottico con ingrandimento 40x. Anche se non è stata effettuata alcuna concentrazione di feci (in un ambiente di campo), il metodo di flottazione semplice ha affrontato le carenze di rilevamento morfologico delle uova nelle feci quando la procedura è stata eseguita secondo il metodo attuale. (C) Uova di T. canis e Ancylostoma spp. rilevate al microscopio ottico utilizzando un ingrandimento 40x. Le caratteristiche morfologiche di queste uova (recuperate in laboratorio) erano chiare anche se non era stata effettuata alcuna concentrazione di campioni di feci e non differivano dalle uova recuperate in un ambiente di campo. Barre di scala = 75 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ancylostoma spp. | Canis di Toxocara | ||
| Clima | Clima caldo | Il 38.66 | Il 22.52 |
| Clima secco | Il 29.41 | Il 36.03 | |
| Clima temperato | Il 31.93 | 41.44miliardi | |
| Primavera | Il 23.76 | Il 19.81 | |
| Estate | 49.81miliardi | 50,00miliardi di euro | |
| Autunno | Il 17.52 | Il 20.27 | |
| Inverno | 8,88c | 9,90c | |
| Genere | Maschio | Il 60.86 | Il 62.61 |
| Femmina | 39.13b | 37.38miliardi | |
| Età | 0-3 mesi | Il 18.72 | Il 51,80 |
| 3-6 mesi | Il 15.48 | 32.43miliardi | |
| > 6 mesi | Il 22.44 | 10,36c | |
| > 1 anno | 43.33b | 5,40c | |
| Razza | Incrociato | Il 52.78 | Il 55.86 |
| Razza | Il 47.22 | Il 44.14 | |
| Stato dell'alloggio | Interno | Il 34.45 | Il 52.25 |
| All’aperto | Il 65.54 | 47,74miliardi |
Tabella 2: Prevalenza (%) di Ancylostoma spp. e Toxocara canis nei cani in Messico durante 4 anni in base al clima, alla stagione, al sesso, all'età, alla razza e allo stato di stabulazione. Le indicazioni dei dati rivelano che non vi è alcuna variazione significativa nella prevalenza di Ancylostoma spp. nelle aree caratterizzate da climi caldi, temperati o secchi. Al contrario, T. canis mostra una prevalenza notevolmente maggiore nei climi temperati e secchi rispetto ai climi caldi. Inoltre, sia Ancylostoma spp. che T. canis sono più frequentemente identificati durante la stagione estiva. L'analisi dei dati dimostra inoltre che il 60,86% dei cani maschi è risultato positivo all'ancylostomiasi, mentre il 37,38% è risultato positivo alla toxocariasi. Inoltre, T. canis è più comunemente rilevato nei cuccioli di età inferiore ai 6 mesi, mentre Ancylostoma spp. è più diffuso nei cani adulti. È interessante notare che non sono state osservate differenze distinguibili tra le varie razze di cani. I risultati indicano che il 65,54% dei cani che vivono all'aperto è infetto da anchilostomi canini, mentre T. canis è ugualmente prevalente tra i cani che vivono in casa e all'aperto. *I valori medi all'interno di una colonna del fattore (Clima, Stagione, Sesso, Età, Razza e Abitazione) seguiti dalle stesse lettere non sono significativamente diversi a P < 0,05 secondo il test ANOVA.
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Discussion
I nematodi come T. canis e Ancylostoma spp. possono abitare l'intestino tenue dei cani e hanno il potenziale per essere trasmessi all'uomo. I segni clinici causati da T. canis sono gravi nei cani giovani e si manifestano con scarsa crescita, problemi respiratori o lesioni del tratto digestivo28. Nei cani adulti, l'infezione tende in genere ad essere lieve. La diagnosi si basa sull'identificazione delle uova caratteristiche in un campione fecale. Questa condizione è una causa frequente per la prescrizione di trattamenti antielmintici ai cani29. Per comprendere l'epidemiologia di Toxocara, è fondamentale riconoscere che il parassita può trasferirsi dalla madre al cucciolo sia attraverso la placenta prima della nascita che attraverso l'allattamento come infezione galattogena poco dopo il parto. Gli esseri umani possono contrarre T. canis quando ingeriscono uova infette, che possono verificarsi attraverso vari mezzi come il terreno contaminato o il pelo di un cane infetto. In questo caso, gli esseri umani fungono da ospiti paratenici e, sebbene non vi sia riproduzione parassitaria, le larve rilasciate dalle uova possono potenzialmente causare danni, in particolare nel caso dei bambini30.
L'infezione da anchilostoma Ancylostoma spp. nei cani si verifica quando gli animali ingeriscono le larve o quando le larve penetrano nella pelle. I cuccioli possono contrarre l'infezione consumando un ospite paratenico o attraverso la via lattogenica31. Gli anchilostomi maturi si nutrono di sangue, portando potenzialmente a grave anemia e sintomi gastrointestinali, in particolare nei cani giovani. Le infezioni che si verificano attraverso la pelle provocano dermatite, che in genere si risolve circa una settimana dopo l'insorgenza dell'infezione. Sono stati impiegati vari farmaci antielmintici, accompagnati da una terapia di supporto. Tuttavia, ci sono state segnalazioni di resistenza antielmintica. L'ancylostoma ha il potenziale per essere patogeno per l'uomo. La trasmissione transcutanea delle larve L3 può portare a una condizione nota come larva migrans cutanea. Queste lesioni generalmente si risolvono senza trattamento nell'arco di pochi mesi. In rari casi, gli anchilostomi canini possono migrare nel tratto gastrointestinale umano, inducendo enterite eosinofila30.
La diagnosi accurata, economica e rapida della parassitosi nei cani è essenziale per aumentare la nostra conoscenza epidemiologica delle elmintiasi canine canine. Per questo motivo, abbiamo adattato un protocollo della tecnica di flottazione semplice da utilizzare in un ambiente di campo per rilevare T. canis e Ancylostoma spp. Un problema rilevante affrontato nell'attuale protocollo è stata la raccolta di campioni da cani selvatici, poiché questi animali sono solitamente difficili da maneggiare. Pertanto, il campionamento è stato effettuato osservando e seguendo i cani fino a quando non hanno defecato, rendendo il metodo di campionamento dispendioso in termini di tempo, impegnativo e in qualche modo pericoloso. In base alla nostra esperienza, consigliamo vivamente di valutare gli studi parassitologici nei cani da rifugio.
Per quanto riguarda il recupero degli ovociti zoonotici da elminti, la coproscopia qualitativa continua ad essere la metodologia comunemente utilizzata nel laboratorio di parassitologia a scopo diagnostico1. Studi precedenti hanno scoperto che la tecnica di flottazione che utilizza una soluzione salina satura è più affidabile della microscopia diretta. Ad esempio, Dryden e collaboratori hanno determinato una sensibilità del 95,15% per le uova di Ancylostoma spp. in 206 campioni fecali processati con la tecnica di flottazione e del 27,18% mediante microscopia diretta32. È accettato che la densità della soluzione di flottazione sia un fattore critico per il metodo di flottazione 14,20,23. Nelle soluzioni che non raggiungono tale densità, le forme parassite impiegano più tempo a galleggiare o non galleggiano mai. Quando una soluzione di flottazione è sovrasatura, cristallizza in un paio di minuti e anche prima se viene posizionato un vetrino coprioggetto20.
La scelta della soluzione di flottazione in questo protocollo si è basata sulla facilità di preparazione, sulla praticità, sul costo e sull'impatto ambientale. Anche se la soluzione zuccherina impiega più tempo a cristallizzare, la formalina o il fenolo dovrebbero essere aggiunti come conservanti e ridurre la sensazione appiccicosa o collosa; che è un inconveniente nelle condizioni di campo che hanno prevalso in questo studio. Inoltre, lo smaltimento dei reagenti chimici è una questione complessa a causa delle normative ambientali. I dati di questo studio hanno dimostrato che la soluzione satura preparata con sale da cucina comune in condizioni di campo utilizzando una bottiglia di soda a causa della mancanza di disponibilità di attrezzature di laboratorio per preparare e far bollire una soluzione di flottazione, era efficace quanto quella preparata in un ambiente di laboratorio. L'unica differenza percettibile è il tempo più lungo necessario per agitare la bottiglia di soda fino a quando non si vede una soluzione trasparente. Le osservazioni microscopiche sono risultate ugualmente pulite per il campione preparato utilizzando entrambi i metodi per preparare la soluzione satura. È importante eseguire ulteriori studi in futuro con un numero maggiore di campioni per confermare l'affermazione di cui sopra. Tuttavia, richiede molto tempo e richiede lo sforzo fisico di agitare la soluzione all'interno del flacone per ore. Un'altra fase critica del protocollo consiste nel lasciare riposare la sospensione fecale per almeno 15 minuti per consentire alle uova di galleggiare e concentrarsi sulla superficie. Tuttavia, più lungo è il tempo di riposo, più detriti galleggeranno e dopo alcune ore le uova si deformeranno o si romperanno. Considerando che la sensibilità e la specificità dei metodi coproparassitoscopici sono basse e che l'accuratezza di questi metodi come test diagnostici dipende dalle capacità dell'utente, nel presente studio, parassitologi addestrati ed esperti hanno eseguito la tecnica di flottazione e identificato i parassiti.
Questo studio, per quanto ne sappiamo, è il primo a stimare la prevalenza di Ancylostoma spp. e T. canis nei cani in Messico utilizzando campioni fecali esaminati con il metodo di flottazione semplice in un ambiente di campo. È stato qui dimostrato che la tecnica di galleggiamento che abbiamo utilizzato, nonostante i decenni in cui è stata utilizzata, è ancora un test diagnostico altamente efficace, economico e rapido14. Anche così, esistono tecniche coproparassitoscopiche con maggiore sensibilità e specificità rispetto a quella che abbiamo utilizzato per la diagnosi degli elminti del cane; come la concentrazione di sedimentazione, come nel caso della tecnica Faust. Inoltre, è importante notare che Faust, che è un metodo di concentrazione, ha anche dimostrato di essere più efficace nell'individuazione di protozoi come Giardia33. Tuttavia, il metodo coproparassitoscopico che abbiamo scelto per questo studio presentava diversi vantaggi come il costo. La tecnica Faust è più costosa della flottazione con soluzione satura di soluzione salina perché richiede attrezzature aggiuntive e costose come una centrifuga. Altri metodi di concentrazione, come quelli che utilizzano reagenti come il solfato di zinco, sono più costosi del sale comune e richiedono più tempo a causa del numero di lavaggi richiesti nella centrifuga. Pertanto, la tecnica Faust è limitata per il suo uso nel lavoro sul campo dove non è comune l'accesso a una centrifuga.
Ancora più importante, un limite della tecnica di flottazione semplice è che non è abbastanza sensibile da rilevare oocisti di Cryptosporidium , cisti di Giardia o uova di Trichuris . Le tecniche che utilizzano procedure di centrifugazione per concentrare le forme di parassiti dovrebbero quindi essere utilizzate se si intende la diagnosi di queste specie. È importante sottolineare che i tassi di positività dei generi riportati in questo studio non devono essere considerati conclusivi perché è stato utilizzato un metodo di convenienza come strategia di campionamento. È importante notare che potrebbero esserci situazioni, come nei rifugi con una gestione degli animali difficile, in cui diventa fondamentale identificare i parassiti elminti nei cani. Di conseguenza, questo protocollo potrebbe richiedere aggiustamenti in futuro per consentire la raccolta di campioni combinati.
Come punto debole, va notato che il metodo di flottazione semplice e la preparazione della soluzione satura di NaCl sono stati sviluppati per uno scopo specifico - esaminare le feci di cane in condizioni per lo più di campo - ma la sensibilità della semplice procedura di flottazione è stata generalmente considerata bassa. Pertanto, per rilevare cisti o uova di specie parassitarie più pesanti, è fortemente suggerito l'uso di una tecnica di concentrazione. Data la bassa sensibilità del metodo di flottazione semplice, indipendentemente dal fatto che venga eseguito in un campo o in un ambiente di laboratorio, era ragionevole dubitare che questa tecnica sarebbe stata utile come metodo di scelta per gli studi epidemiologici sui parassiti elminti canini. Ciononostante, l'elevata prevalenza di Ancylostoma spp. nei cani in questo studio e il rilevamento delle uova di T. canis indicano che il metodo di flottazione semplice, eseguito in campo o in laboratorio, è utile per fornire prove che potrebbero supportare ulteriori studi epidemiologici e proporre misure di controllo e preventive per ridurre l'infezione di cani e umani con questi nematodi.
Utilizzando il semplice metodo di flottazione, abbiamo analizzato i fattori che influenzano il recupero delle uova di T. canis e Ancylostoma spp. dalle feci canine. I risultati di T. canis sono in accordo con le ultime ricerche che indicano che i parassiti sono notevolmente più diffusi nelle regioni temperate e tropicali. Ciò è in linea con studi precedenti che hanno indagato su come i fattori ambientali, in particolare la temperatura e le precipitazioni, influenzino l'areale ecologico delle specie di parassiti 34,35,36. I risultati attuali hanno mostrato che entrambi gli elminti infettano i maschi in una proporzione significativamente più alta. È ragionevole ipotizzare che questo risultato sia dovuto al fatto che i maschi sono immunologicamente meno reattivi alle infezioni37,38. L'età influenza la prevalenza di T. canis poiché i cuccioli sono stati più colpiti da questo parassita. Questa scoperta è in linea con ricerche precedenti che indicavano che questo parassita tende ad avere un impatto maggiore sui cuccioli, mentre gli adulti sviluppano una maggiore resistenza, con conseguente minore probabilitàdi infezione. Sia i cani incrociati che quelli di razza pura hanno mostrato prevalenze comparabili di Toxocara canis e Ancylostoma spp. Tuttavia, i cani inselvatichiti hanno mostrato una maggiore prevalenza di Ancylostoma spp. rispetto ai cani residenti in ambienti domestici. Questo risultato è in disaccordo con i rapporti precedenti che non hanno rilevato differenze tra le razze canine6. Si può concludere che le future applicazioni della preparazione della soluzione salina satura e del metodo di flottazione semplice utilizzato in questo protocollo possono essere condotte per esami fecali di routine in condizioni di campo o di laboratorio.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati alla Dirección General de Asuntos del Personal Académico dell'Universidad Nacional Autónoma de México per aver fornito le risorse finanziarie attraverso la sovvenzione PAPIIT IN218720 e alla dottoressa Claudia Mendoza per aver concesso la proroga richiesta. Questo lavoro è dedicato alla mia adorabile Nicole, scomparsa nel 2019. Vivrai sempre nel mio cuore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
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