Summary
这项工作描述了使用浮选方法鉴定 2017 年至 2021 年在野外条件下从墨西哥狗身上收集的粪便样本中检测到 的犬弓蛔虫 和 Ancylostoma spp.。
Abstract
由于墨西哥农村和郊区的实验室有限，在野外条件下诊断具有人畜共患潜力的犬类寄生虫，如 犬弓蛔 虫和 犬弓 蛔虫，通常很困难。本研究旨在检测 2017 年至 2021 年在野外条件下从墨西哥狗身上采集的粪便样本中的犬 锥虫 和 Ancylostoma spp.。样本量计算得出全国 534 只狗的目标招募。
排便后直接从直肠或地面采集样本。将样品储存在4°C的单独密封塑料袋中。 在现场和实验室条件下制备氯化钠饱和溶液（比重 [SpG] 1.20）。在收集后3天内，通过将每个粪便样品悬浮在盐水溶液中，使用浮选方法测试2-4g粪便的寄生虫。将粪便与浮选液混合，并用金属勺压碎。
一旦达到均匀的稠度，用筛子将粪便样品倒入新的塑料杯中，静置10-15分钟。使用灭菌接种环从混合物顶部收集三滴。将载玻片放在显微镜上，由训练有素的寄生虫学家识别寄生虫。对1,055只狗的粪便样本进行了显微镜筛查。犬 绦 虫阳性样本数为833个（78.95%）， 犬绦虫阳性样本数为222个（21.04%）。这些发现说明了在实验室和野外条件下使用寄生虫镜技术识别生活在墨西哥城市和农村地区的狗中的人畜共患蠕虫的重要性。
Introduction
胃肠道寄生虫是影响狗的最常见健康问题之一1.据估计，全世界有 ~7 亿只家犬，大约 1.75 亿只可归类为自由漫游2。狗和人类之间共有 60 多种寄生虫，这表明狗可能是人类感染这些寄生虫的感染源3.犬弓蛔虫和犬弓蛔虫是两种寄生物种，它们会感染狗，并意外地感染人类宿主。目前，有几项关于这些蠕虫能够在墨西哥生存和繁殖的地点的研究。在美国、墨西哥、中美洲和加勒比地区，狗弓蛔虫的患病率从 0% 到 87% 以上不等4.犬弓蛔虫属（Toxocara canis）和犬弓蛔虫属（Ancylostoma spp.）以及狗的其他寄生物种，以前在墨西哥报道过5,6,7,8,9,10,11,12,13（表1）。
| 寄生物种 | 地区 | 患病率 （%） | 参考 |
| 犬棘口 | 克雷塔罗 | 42.90 | 5 |
| 塔巴斯科州 | 15.90 | 6 | |
| 坎佩切 | 35.7 – 42.9 | 7 | |
| 尤卡坦州 | 73.8 | 8 | |
| 巴贝虫 | 莫雷洛斯 | 13.60 | 9 |
| 韦拉克鲁斯 | 10.00 | ||
| 球虫卵囊 | 尤卡坦州 | 2.30 | 8 |
| 栉头菌类 | 莫雷洛斯 | 30.3 | 10 |
| 犬双歧杆菌 Dipylidium caninum | 尤卡坦州 | 2.30 | 8 |
| Dirofilaria | 尤卡坦州 | 7.0 – 8.3 | 11 |
| 贾弟虫 | 塔巴斯科州 | 3.00 | 6 |
| 尤卡坦州 | 18.8 | 8 | |
| 利什曼原虫 | 恰帕斯 | 19.00 | 12 |
| 绦虫 | 下加利福尼亚州 | 6.79 | 13 |
| 犬弓蛔虫 | 克雷塔罗 | 22.10 | 5 |
| 尤卡坦州 | 6.20 | 8 | |
| Trichuris vulpis （英语：Trichuris vulpis） | 尤卡坦州 | 25.40 | 8 |
| 锥虫属 | 哈利斯科州 | 8.10 | 9 |
| 坎佩切 | 7.60 | ||
| 恰帕斯 | 4.5 – 42.8 | ||
| 金塔纳罗奥州 | 20.1 – 21.3 | ||
| 托卢卡 | 17.50 | ||
| 尤卡坦州 | 9.8 – 34 |
表 1：2001 年至 2020 年墨西哥狗寄生虫的区域流行率 （%）。 从2001年到2020年进行的先前调查的结果使得能够识别出犬类寄生虫在墨西哥几个城市和农村环境中的分布。这些研究深入了解了有利于犬类寄生虫在不同生态系统中持续存在的流行病学因素，有助于全面评估某些寄生虫物种的人畜共患影响。
肠道寄生虫（如卵、囊肿、卵囊或幼虫）的生命周期阶段可以在粪便样本中找到。因此，对粪便物质的检查提供了有关动物寄生虫的宝贵信息。1878 年，由于需要一种方法来检测人类粪便中的 Ancylostomidae 卵，因此使用了简单的粪便涂片，该涂片多年来一直用于检测胃肠道寄生虫，但被认为不是很敏感。因此，需要开发更好的共显微镜方法14.自首次描述用于回收和计数粪便样本中寄生虫卵的浮选技术以来，已经过去了100 多年 15.从那时起，浮选技术的几种方法和变体被认为是检测宿主中某些寄生虫的标准。
例如，Lane 在 1924 年描述了一种涉及直接离心浮选技术的方法，该技术将离心过程一体化，然后将沉积物漂浮在饱和氯化钠溶液中，SpG 为 1.2 in 1 g（Lane）或 10 g（Stoll 的改进）。随后通过使用具有不同SpG14的溶液对浮选技术进行了修改。1939 年，Gordon 和 Whitlock 报告了 Stoll 技术的缺点，即由于碎屑干扰寄生虫卵的可视化，并开发了称为 McMaster16 的定量方法。1979 年，O'Grady 和 Slocombe 证明，溶液的比重、时间和过滤器的网孔尺寸会影响使用浮选技术检测鸡蛋的准确性 17。在过去的几十年里，由于对浮选技术进行了一些修改，迫切需要对浮选方法进行标准化。目前，需要在预防人畜共患寄生虫的背景下检测犬蠕虫感染，以应用适当的驱虫治疗，以限制人畜共患线虫传染性阶段的环境污染18。
在定性方法中，粪便浮选技术被广泛使用和接受，因为它不需要太多设备，简单、便宜、可重复;然而，它有一个主要缺点，即当感染强度较低时，它缺乏敏感性19.揭示大量寄生元件（如卵、卵囊、包囊或线虫幼虫）的存在的能力通常由溶液20的密度决定。
以前的报告比较了用于检测犬线虫卵的寄生虫学技术。关于运动原生动物的检测，使用直接粪便涂片;而沉降方法可用于诊断吸虫等寄生虫的重卵21.粪便涂片法是应用最广泛的现场诊断测试之一。然而，这种技术的灵敏度低可能归因于它确实含有干扰寄生虫卵检测的碎片。通过将筛分步骤与提供适当SpG的溶液相结合，浮选方法可以更清晰、更不杂乱地观察蛔虫和钩虫卵。这导致了更精确和高效的显微镜筛选过程22。同样，简单的浮选和直接离心浮选技术也非常常用于回收寄生虫卵和卵囊14。经典的浮选方法可以被认为是定性的或定量的，这取决于计数室的使用，如麦克马斯特方法15。尽管如此，由于浮选技术的灵敏度较低，并且侧重于专利期内寄生虫的检测，因此不应将阴性结果视为决定性结果。然而，准确性不仅取决于粪便样品的保存程序或浮选溶液的SpG，还取决于用户进行粪便检查的技术熟练程度和经验。
因此，已经探索了其他方法来检测粪便中的犬类寄生虫。人们普遍认为，诊断狗肠道蠕虫感染最广泛使用的方法之一是 FLOTAC 技术，这是一种多价、灵敏和准确的方法，与管中的浮选方案和 McMaster 技术相比，可为诊断狗 的犬蠕虫产生 准确可靠的结果19，23.沉降方法可用于回收吸虫卵、胚胎线虫卵和大多数绦虫卵，这些卵不能在浮选液表面回收，因为这些结构不漂浮24.一种已被证明优于浮选/沉降技术的方法是改良的双离心浮选法，因为它能够检测粪便中的绦虫卵，耗时更少，将 Anoplocephala 卵与粪便碎片分离，并减少结晶25。此外，该技术已成功用于检测高灵敏度的蛔虫卵26。然而，与本研究中提出的浮选方案相反，上述一些技术和离心方法（例如 Ovassay）需要将样品保存在福尔马林等试剂中、商业试剂盒、实验室条件下的样品处理以及使用硫酸锌27 等试剂，这些试剂价格昂贵且需要特殊的处置程序以避免环境毒性。
最近，人们倾向于使用通过添加高SpG溶液来提高浮选方法灵敏度的技术。然而，必须考虑到这些解决方案的缺点是最终制备过程中碎片的增加，因此寄生虫卵的检测不准确。此外，材料、试剂的商业可用性、成本、环境影响问题以及离心方法的使用难度影响了浮选技术的选择 14，与我们在这项工作中提出的方案相比，浮选技术在现场条件下可能具有挑战性。用食盐制备浮选液比利用糖更有利，因为在田间条件下，糖会吸引黄蜂和蜜蜂等昆虫，并使制剂变得粘稠。此外，苯酚等溶液（为避免粘性而添加到糖溶液中）或 ZnSO4等溶液根据环保准则难以正确丢弃，不能在现场处置;与食盐溶液不同。
本手稿的目的是演示在现场和实验室条件下使用简单浮选技术检测粪便样品中犬 绦虫 和 犬绦虫 卵的步骤。按照本文描述的方案并使用带有备用电池的显微镜，在没有实验室设备和基础设施的情况下，可以在农村和郊区诊断这些犬类人畜共患寄生虫。本文中描述的简单浮选方法可以快速提供结果，是一种非侵入性且具有成本效益的常规筛选技术。
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Protocol
狗的使用和护理得到了墨西哥国立自治大学的批准。
1. 粪便样本采集
注意： 在兽医或动物主人的帮助下处理狗。
- 对于野狗（图1A）或紧张的动物，在排便后立即或不超过10分钟后从地面收集样本。
- 用水或凡士林润滑手术手套或薄壁聚乙烯袋。要从直肠收集粪便样本，请戴上手术手套或薄壁聚乙烯袋。
- 从每只狗身上收集至少2克粪便（图1B）。
- 按如下方式识别单个粪便样本：日期、位置（使用谷歌地图的全球定位系统 [GPS] 坐标）、为每只动物分配一个识别号、狗的大致年龄、狗的性别、品种、室内或室外（野）狗。
- 用一个紧结关闭装有粪便样本的袋子。如果在收集后3-4小时内未分析粪便样品，则将袋子冷藏（4-8°C）。
2.制备用于现场诊断的饱和盐溶液
注意：如果无法获得天平、测量材料、炉子或燃气来烧开水或受到限制，则可以使用水、普通食盐、12 盎司（355 毫升）塑料杯和 1 升苏打水塑料空瓶轻松制备饱和盐水溶液。
- 彻底清洗一个空的 1 升汽水瓶。用 1 升水装满瓶子。
- 用普通食盐装满一个 12 盎司的塑料杯。
- 将盐转移到汽水瓶中。
- 用螺旋盖紧紧苏打水瓶。剧烈摇晃溶液，直到盐不再溶解。
注意：在汽水瓶中摇晃溶液直到盐完全溶解可能需要长达 90 分钟的时间。
3.制备用于实验室诊断的饱和盐溶液
- 称取420克普通食盐。
- 将 420 克盐溶解在 1 升水中。
- 将溶液煮沸，直到不再有盐溶解。
- 过滤溶液以丢弃未溶解的盐。
- 使用重流体比重计或密度计检查溶液的浓度。
注意：理想浓度的SpG为1.20，以获得更好的结果（图2A）。鸡蛋的漂浮能力受其与溶液相互作用的影响，导致鸡蛋在具有相同比重的溶液中漂浮的能力不同。因此，为了实现最佳的卵回收率，必须考虑浮选液中的比重上限范围，确保其超过目标寄生虫元素的比重范围6。
4.浮选法
注意： 如果粪便样品太干或太硬，请将它们浸渍在研钵中。
- 用勺子将大约 3 克粪便放入一个塑料杯（高 ~8.5 厘米，直径 ~5.5 厘米）中。
- 加入 1 mL 饱和盐溶液，直至获得糊状物。
- 搅拌 1 分钟，加入 100 mL 饱和盐溶液。
- 将该悬浮液通过塑料过滤器进入第二个塑料杯中，以避免产生粗颗粒（图2B）。
- 让悬架静置 15-20 分钟。
- 将接种环置于火焰中1秒，以确保其没有卵，囊肿或卵囊（图2C）。
- 等待5秒，使接种环冷却（图2D）。
- 用接种环从悬浮液表面滴三滴。将三滴中的每一滴分别放在一个载玻片上（图2E-G）
注意：确保液滴不相互接触（图2H）。 - 用10倍物镜在显微镜下观察（图2I）。如果放大倍数增加到 40 倍，请放置盖玻片。
- 当在液滴中观察到阳性结果时，在实验室日志中分配一个叉号 （+），以记录专利期内粪便悬浮表面随机部位寄生虫的存在。
五、浮选法解读
注意：阴性结果尚无定论。
- 对连续 3 天的样品进行一系列的三项测试，以提高测试的灵敏度。
注：阳性结果表明专利期内存在寄生虫。
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Representative Results
在这项工作中，描述了用于鉴定 犬绦虫 和 犬绦虫 属的收集和共寄生虫镜程序。采用简单的粪便浮选方法检测犬蠕虫卵的基本原理是，由于解决方案、设备和材料价格低廉，因此该技术具有成本效益。因此，该方法具有很高的样品处理能力，因为可以在短时间内处理多个样品。此外，简单的粪便浮选方法易于执行且相对敏感。
动物的样本量和选择主要取决于动物主人的意愿和接近野狗的安全性。在本研究中，从2017年开始的4年内，使用浮选法评估了墨西哥犬狼疮犬犬（Canis lupus familiaris）犬中Ancylostoma spp.和T. canis的发生率和频率。收集了 1,638 只狗的粪便样本并进行了显微镜筛查。共有 1,235 只狗对 T. canis 和 Ancylostoma spp 呈阳性反应。采用浮选法的目的之一是证明其在测量弓蛔虫或弓形虫的发生方面的有效性，但我们也旨在对可能影响其患病率的因素进行更深入的研究。因此，185只混合感染的动物被丢弃。犬绦虫阳性样本数为833个（78.95%），犬绦虫阳性样本数为222个（21.04%）。在 1,050 个样品中，75.5%（793 个样品）通过用汽水瓶制备浮选溶液并使用带有 3 x 1.2 V AA 可充电电池的显微镜连续运行 4 小时，在现场环境中进行处理和读取。其余257份粪便样本在实验室进行了检查。
本研究的一个目标是在野外环境中使用浮选溶液和方法，以加快和促进在没有实验室基础设施或设备的地区对两种狗的蠕虫寄生虫的诊断。浮选法的现场应用使我们能够在每次显微镜读数后立即将结果传达给 400 名所有者，以提供有关驱虫治疗和预防措施的建议，从而避免寄生虫在人类或伴侣动物中传播。同样，野外环境中的漂浮技术使得检查野狗并使用零食或食物为它们提供驱虫治疗成为可能。 图3A 和 图3B 分别显示了在田间环境中完成浮选溶液和技术后观察到的 犬锥虫 和 Ancylostoma spp.的卵。当新鲜粪便样品在田间环境中进行浮选法时，在汽水瓶中制备的溶液能够将蠕虫卵带入浮选。将盐晶体和气泡的产生与在实验室环境中读取的样品进行比较，操作人员未检测到差异。这一观察结果令人鼓舞，并挑战了粪便样本浓度保证更准确的显微读数的知识。
当在实验室环境中处理浮选液和粪便样品时，在显微镜下读数的形态和清晰度方面没有差异，因为在寄生虫的现场和实验室显微镜检测中同时漂浮相同数量的碎片。 图3A，B 分别显示了从城市、郊区和农村地区运输样本后，从设备齐全的实验室环境中处理的257个样本中回收的 犬锥虫 和 Ancylostoma spp.卵。这些寄生虫卵在形态上与在野外条件下观察到的寄生虫卵没有区别（图3C）。
该协议产生了足够数量的发现，以评估位置，一年中的季节，性别，品种，年龄以及室外或室内条件对 犬绦虫 和 Ancylostoma 属患病率的影响。使用方差分析检验比较患病率数据，显著性值为 0.05。 表 2显示，与以温暖气候为特征的州相比，犬 绦 虫在温带和干燥气候中的分布频率明显更高，而在温暖、温带或干燥气候占主导地位的地区， 犬绦 虫属的患病率没有显著变化。同样， Ancylostoma spp. 和 T. canis 最常在夏季被发现。结果发现，60.86%的男性对弓形虫病阳性，37.38%对弓蛔虫病阳性。此外，在6个月以下的幼犬中更常检测到 犬绦虫 ;而 Ancylostoma spp. 在成年犬中诊断得更多。有趣的是，不同犬种之间没有发现差异。狗钩虫感染了65.54%的户外狗;然而，在具有室外或室内状态的狗中同样检测到 犬锥虫 。
图1：从狗身上采集粪便样本。 （A） 采集野狗粪便样本时必须小心谨慎。如果可能，必须收集新鲜粪便并保存在塑料袋中，以便在实验室中提交和共同寄生虫镜分析。样品必须在4°C下冷藏，并在收集后24小时内放入聚苯乙烯泡沫塑料盒或绝缘金属信封中。（B） 建议以3克粪便为标准;因此，2-5 克是合理的。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：制备饱和盐溶液并处理粪便悬浮液进行显微镜检查。 （A） 用盐制成的饱和溶液的理想密度应超过1.20。强烈建议检查底部是否有结晶，溶液是否透明。（B） 将粪便悬浮液通过塑料过滤器可去除粗颗粒。（C） 接种回路必须暴露在火焰（实验室燃烧器或普通便携式打火机）中，以确保其不受污染。（D） 让接种环冷却并从悬浮液表面的不同部位滴取三滴。（E） 将第一滴液滴放在载玻片上后，避免移动载玻片，以减少液滴的溢出。载玻片提供了一个薄而透明的平台，可以观察样品。（F） 将第二个液滴放在载玻片的中间。从粪便悬浮液表面取下第二滴会增加在寄生结构可能分布不均匀的悬浮液中找到卵的可能性。（G） 将第三个液滴放在载玻片上。从粪便悬浮液表面滴下的第三滴将允许观察漂浮卵可能聚集的另一个区域。（H）在载玻片上分别观察三滴，以检测粪便悬浮液表面不同区域的线虫卵。（I） 使用 10 倍物镜在显微镜下观察样品。如果物镜更改为 40 倍，请在粪便悬浮液滴上放置盖玻片。当在液滴中观察到阳性结果时，分配一个叉号 （+） 以标记在粪便悬浮表面的随机部位的专利期内存在寄生虫的存在。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用 40 倍放大倍率通过光学显微镜检测到 的犬弓蛔 虫和 犬 弓蛔虫的卵。 （A） 使用40倍放大倍率通过光学显微镜检测 犬弓蛔虫 的卵。浮选方法允许可视化没有粗材料（在现场环境中收集）的干净微观场。无论浮选溶液的制备方法如何，卵都是可见的，并且主要观察到没有形态改变。（B） 使用40倍放大倍率通过光学显微镜检测的 Ancylostoma spp.的卵。即使没有进行粪便浓缩（在野外环境中），当按照本方法进行程序时，简单的浮选方法解决了粪便中卵的形态学检测的缺点。（C） 犬 绦虫 和 犬绦虫 属的卵，使用40倍放大倍率通过光学显微镜检测。即使没有对粪便样本进行浓缩，这些卵子（在实验室环境中回收）的形态特征也很清晰，并且与在野外环境中回收的卵子没有区别。比例尺 = 75 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
| Ancylostoma spp.（英茜病菌属） | 犬弓蛔虫 | ||
| 气候 | 气候温暖 | 38.66安培 | 22.52安培 |
| 干燥气候 | 29.41安培 | 36.03安培 | |
| 温带气候 | 31.93安培 | 41,44字节 | |
| 春天 | 23.76安培 | 19.81安培 | |
| 夏天 | 49.81字节 | 50.00乙 | |
| 秋天 | 17.52安培 | 20.27安培 | |
| 冬 | 8.88摄氏度 | 9.90摄氏度 | |
| 性 | 雄 | 60.86安培 | 62.61安培 |
| 女性 | 39.13乙 | 37.38字节 | |
| 年龄 | 0-3个月 | 18.72安培 | 51.80安培 |
| 3-6个月 | 15.48安培 | 32.43字节 | |
| > 6个月 | 22.44安培 | 10.36摄氏度 | |
| > 1年 | 43.33字节 | 5.40摄氏度 | |
| 品种 | 杂交 | 52.78安培 | 55.86安培 |
| 纯种的 | 47.22安培 | 44.14安培 | |
| 住房状况 | 室内的 | 34.45安培 | 52.25安培 |
| 户外的 | 65.54安培 | 47.74字节 |
表 2：根据气候、季节、性别、年龄、品种和住房状况，墨西哥犬 4 年内犬类中 Ancylostoma spp. 和 Toxocara canis 的患病率 （%）。 数据表明，在温暖、温带或干燥气候的地区， Ancylostoma spp. 的患病率没有显着差异。相比之下，与温暖气候相比， 犬锥虫 在温带和干燥气候中的患病率明显更高。此外， Ancylostoma spp. 和 T. canis 在夏季最常被发现。数据分析进一步表明，60.86%的公犬经检测呈阳性，而37.38%的公犬经检测呈弓蛔虫病阳性。此外， 犬毛滴虫 在6个月以下的幼犬中更常见，而 Ancylostoma spp.在成年犬中更为普遍。有趣的是，在各种犬种之间没有观察到明显的差异。研究结果表明，65.54%的户外狗感染了狗钩虫，而 犬锥虫 在室内和室外狗中同样普遍。*根据方差分析检验，因子（气候、季节、性别、年龄、品种和住房）后跟相同字母的一列内的平均值在 P < 0.05 时没有显着差异。
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Discussion
犬线虫和犬线虫等线虫可以栖息在狗的小肠中，并有可能传播给人类。犬绦虫引起的临床症状在幼犬中很严重，表现为生长不良、呼吸系统问题或消化道病变28.在成年犬中，感染通常趋于轻微。诊断依赖于识别粪便样本中的特征性虫卵。这种情况是给狗开驱虫药治疗的常见原因29.要了解弓蛔虫的流行病学，必须认识到寄生虫可以在出生前通过胎盘从母亲转移到小狗身上，也可以在分娩后不久通过哺乳作为致乳性感染。人类在摄入感染性虫卵时会感染犬毛虫，这可以通过各种方式发生，例如受污染的土壤或受感染狗的皮毛。在这种情况下，人类作为寄生宿主，虽然没有寄生繁殖，但从卵中释放的幼虫可能会造成伤害，尤其是在儿童的情况下 30.
当动物摄入幼虫或幼虫穿透皮肤时，就会发生狗钩虫 Ancylostoma spp. 感染。幼犬可以通过食用寄生宿主或通过泌乳途径31感染感染。成熟的钩虫以血液为食，可能导致严重的贫血和胃肠道症状，尤其是在幼犬中。通过皮肤发生的感染会导致皮炎，通常在感染发作后一周左右消退。已经使用了各种驱虫药物，并伴有支持性治疗。然而，有关于驱虫药耐药性的报道。 Ancylostoma 有可能对人类致病。L3幼虫的经皮传播可导致一种称为皮肤幼虫移行症的疾病。这些病变通常无需治疗即可在几个月内消退。在极少数情况下，犬钩虫可能迁移到人体胃肠道，诱发嗜酸性粒细胞性肠炎30。
准确、经济、快速地诊断狗寄生虫病对于增加我们对狗蠕虫病的流行病学知识至关重要。出于这个原因，我们采用了一种简单的浮选技术方案，用于现场环境，以检测 犬绦虫 和 犬绦虫 属。当前协议中面临的一个相关问题是从野狗身上收集样本，因为这些动物通常很难处理。因此，采样是通过观察和跟踪狗直到它们排便来完成的，这使得采样方法耗时、具有挑战性，并且在某种程度上很危险。根据我们的经验，我们强烈建议评估收容所犬的寄生虫学研究。
关于人畜共患蠕虫卵的回收，定性镜检查仍然是寄生虫学实验室中用于诊断目的的常用方法1。先前的研究发现，使用饱和盐溶液的浮选技术比直接显微镜更可靠。例如，Dryden和合作者在浮选技术处理的206个粪便样品中确定对 Ancylostoma spp.卵的灵敏度为95.15%，通过直接显微镜32确定为27.18%。公认的是，浮选溶液的密度是浮选方法14、20、23的关键因素。在未达到该密度的溶液中，寄生形式需要更长的时间才能漂浮或从不漂浮。当浮选溶液过饱和时，它会在几分钟内结晶，如果将盖玻片放置20，则甚至更早。
该协议中浮选解决方案的选择是基于易于制备、方便、成本和环境影响。即使糖溶液需要更长的时间才能结晶，也应添加福尔马林或苯酚作为防腐剂，以减少粘性或粘性感;这在本研究中普遍存在的现场条件下是一种不便。此外，由于环境法规，化学试剂的处置是一个复杂的问题。本研究的数据表明，由于缺乏制备和煮沸浮选溶液的实验室设备，在田间条件下使用汽水瓶制备的饱和溶液与在实验室环境中制备的饱和溶液一样有效。唯一可察觉的区别是摇晃汽水瓶所需的时间更长，直到可以看到透明溶液。对于使用两种方法制备饱和溶液制备的样品，显微观察结果同样干净。重要的是，将来要用更多的样本进行更多的研究，以证实上述说法。然而，它非常耗时，并且需要花费数小时的体力来摇晃瓶内的溶液。该协议的另一个关键步骤包括让粪便悬浮液静置至少 15 分钟，以使卵漂浮并集中在表面上。然而，静置时间越长，漂浮的碎屑就越多，几个小时后，鸡蛋会变形或破裂。考虑到共寄生虫镜方法的敏感性和特异性较低，并且这些方法作为诊断测试的准确性取决于用户的技能，在目前的研究中，训练有素且经验丰富的寄生虫学家执行了浮选技术并鉴定了寄生虫。
据我们所知，这项研究是第一个使用在野外环境中使用简单浮选方法检查的粪便样本来估计墨西哥狗中 Ancylostoma spp. 和 T. canis 的患病率的研究。本文表明，我们使用的浮选技术尽管已经使用了几十年，但仍然是一种高效、经济和快速的诊断测试14。即便如此，还是有一些寄生虫镜技术比我们用于诊断狗蠕虫的技术具有更高的敏感性和特异性;例如沉降浓度，就像浮士德技术的情况一样。此外，需要注意的是，浮士德是一种浓缩方法，也被证明在检测原生动物（如贾第鞭毛虫 33）方面更有效。尽管如此，我们为本研究选择的共寄生虫镜方法有几个优点，例如成本。浮士德技术比用盐水饱和溶液浮选更昂贵，因为它需要额外的昂贵设备，例如离心机。其他浓缩方法，例如使用硫酸锌等试剂的方法比普通盐更昂贵，并且由于离心机中所需的洗涤次数而需要更多时间。因此，浮士德技术仅限于在没有离心机的情况下进行现场工作。
最重要的是，简单浮选技术的一个局限性是它不够灵敏，无法检测 隐孢子虫 卵囊、 贾第鞭毛 虫囊肿或 毛滴 虫卵。因此，如果打算诊断这些物种，则应使用离心程序浓缩寄生虫形式的技术。需要强调的是，本研究中报告的属的阳性率不应被视为决定性的，因为使用了一种方便的方法作为抽样策略。需要注意的是，在某些情况下，例如在动物管理具有挑战性的收容所中，识别狗体内的蠕虫寄生虫变得至关重要。因此，该协议将来可能需要进行调整，以适应组合样本的收集。
作为一个弱点，应该指出的是，简单的浮选方法和NaCl饱和溶液的制备是为特定目的而开发的 - 在大多数田间条件下检查狗粪便 - 但简单浮选程序的灵敏度通常被认为较低。因此，为了检测较重寄生虫物种的囊肿或卵，强烈建议使用浓缩技术。鉴于简单浮选法的灵敏度较低，无论是在野外还是在实验室环境中进行，人们有理由怀疑该技术是否可作为犬蠕虫寄生虫流行病学研究的首选方法。尽管如此，本研究中狗 的高 Ancylostoma spp. 患病率和犬 锥虫 卵的检测表明，无论是在野外还是实验室环境中进行，简单的浮选方法都有助于提供可能支持进一步流行病学研究的证据，并提出控制和预防措施，以减少狗和人类感染这些线虫。
采用简单的浮选法，分析了影响犬粪绦虫和犬粪卵回收的因素。犬绦虫的发现与最新研究一致，该研究表明寄生虫在温带和热带地区明显更为普遍。这与先前的研究一致，这些研究调查了环境因素，特别是温度和降雨量如何影响寄生虫物种的生态范围34,35,36。目前的结果表明，两种蠕虫感染雄性的比例都明显更高。可以合理地推测，这一发现是因为男性对感染的免疫反应较少37,38。年龄会影响犬绦虫的患病率，因为幼犬受这种寄生虫的影响更大。这一发现与早期的研究一致，表明这种寄生虫往往会在更大程度上影响幼犬，而成虫则会产生更高的抵抗力，从而降低感染的可能性6,39。杂交犬和纯种犬的犬弓蛔虫和犬弓蛔虫的患病率相当。然而，与居住在家庭环境中的狗相比，野狗表现出更高的 Ancylostoma spp. 患病率。这一发现与之前没有检测到犬种差异的报告不一致6.可以得出结论，饱和盐溶液的制备和本方案中使用的简单浮选方法的未来应用可以在现场或实验室条件下进行常规粪便检查。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢墨西哥国立自治大学个人学院总司令部通过PAPIIT IN218720赠款提供财政资源，并感谢Claudia Mendoza博士批准申请延期。这部作品是献给我可爱的妮可的，她于 2019 年去世。你永远活在我心里。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 x 1.2 V AA rechargeable batteries | Energizer | Sold in retail stores | |
| Bunsen burner | Viresa | FER-M224 | |
| Disposable 12-oz glass cup | Uline Mexico | S-22275 | Sold in retail stores |
| Glass slides | Velab, Mexico | VEP-P20 | |
| Inoculating loop | VelaQuin, Mexico | CRM-5010PH | |
| Light Microscope | VelaQuin, Mexico | VE-B2 | |
| Lighter | Bic | J25 | Sold in retail stores |
| One plastic cup (12 oz) | Amazon | ASIN B08C2CRHSH | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic cups (size of a dice or urine sample cup) diameter 5.5 cm and height 8.5 cm, two cups | Amazon | Layhit-Containers-ZYHD192919 | Can be any kitchen plastic reuseable cup |
| Plastic strainer 10 cm | Ecko | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen plastic strainer |
| Soda bottle | Coca-Cola | 1-liter | Sold in retail stores |
| Spoon | Amazon Basics | ASIN B00TUAAVWI | Can be any kitchen spoon |
| Table salt | La Fina | Sold in retail stores |
References
- Duncan, K. T., Koons, N. R., Litherland, M. A., Little, S. E., Nagamori, Y. Prevalence of intestinal parasites in fecal samples and estimation of parasite contamination from dog parks in central Oklahoma. Veterinary Parasitology Regional Studies and Reports. 19, 100362 (2020).
- Kisiel, L. M., et al. Owned dog ecology and demography in Villa de Tezontepec, Hidalgo, Mexico. Preventive Veterinary Medicine. 135, 37-46 (2016).
- Lyons, M. A., Malhotra, R., Thompson, C. W. Investigating the free-roaming dog population and gastrointestinal parasite diversity in Tulúm, México. PLoS One. 17 (10), e0276880 (2022).
- Dantas-Torres, F., et al. TROCCAP recommendations for the diagnosis, prevention and treatment of parasitic infections in dogs and cats in the tropics. Veterinary Parasitology. 283, (2020).
- Cantó, G. J., García, M. P., García, A., Guerrero, M. J., Mosqueda, J. The prevalence and abundance of helminth parasites in stray dogs from the city of Querétaro in central Mexico. Journal Of Helminthology. 85 (3), 263-269 (2011).
- Torres-Chablé, O. M., et al. Prevalence of gastrointestinal parasites in domestic dogs in Tabasco, Southeastern Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 24 (4), 432-437 (2015).
- Cortez-Aguirre, G. R., Jiménez-Coello, M., Gutiérrez-Blanco, E., Ortega-Pacheco, A. Stray dog population in a city of Southern Mexico and its impact on the contamination of public areas. Veterinary Medicine International. 2018, 1-6 (2018).
- Rodríguez-Vivas, R. I., et al. An epidemiological study of intestinal parasites of dogs from Yucatán, Mexico, and their risk to public health. Vector Borne Zoonotic Diseases. 11 (8), 1141-1144 (2011).
- Maggi, R. G., Krämer, F. A review on the occurrence of companion vector-borne diseases in pet animals in Latin America. Parasites & Vectors. 12 (1), 145 (2019).
- Cruz-Vazquez, C., Castro, G., Parada, F., Ramos, P. Seasonal occurrence of Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis (siphonaptera:Pulicidae) infesting dogs and cats in an urban area in Cuernavaca, Mexico. Entomological Society of America. 38 (1), 111-113 (2001).
- Bolio-Gonzalez, M. E., et al. Prevalence of the Dirofilaria immitis infection in dogs from Mérida, Yucatán, Mexico. Veterinary Parasitology. 148 (2), 166-169 (2007).
- Pastor-Santiago, J. A., Flisser, A., Chávez-López, S., Guzmán-Bracho, C., Olivo-Díaz, A. American visceral leishmaniasis in Chiapas, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 86 (1), 108-114 (2012).
- Trasviña-Muñoz, E., et al. Detection of intestinal parasites in stray dogs from a farming and cattle region of Northwestern Wexico. Pathogens. 9 (7), (2020).
- Ballweber, L. R., Beugnet, F., Marchiondo, A. A., Payne, P. A. American Association of Veterinary Parasitologists' review of veterinary fecal flotation methods and factors influencing their accuracy and use--is there really one best technique. Veterinary Parasitology. 204 (1-2), 73-80 (2014).
- Nielsen, M. K. What makes a good fecal egg count technique. Veterinary Parasitology. 296, 109509 (2021).
- Gordon, H. M., Whitlock, H. V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research. 12 (1), 50-52 (1939).
- O'grady, M. R., Slocombe, J. O. D. An investigation of variables in a fecal flotation technique. Canadian Journal of Comparative Medicine. 44 (2), 148 (1980).
- ESCCAP. Worm control in dogs and cats. Guideline 01. European Scientific Counsel Companion Animal Parasites. , (2017).
- Cringoli, G., et al. Ancylostoma caninum: Calibration and comparison of diagnostic accuracy of flotation in tube, McMaster and FLOTAC in faecal samples of dogs. Experimental Parasitology. 128 (1), 32-37 (2011).
- Figueroa, C. J. A. Examen coproparasitoscópico. In: Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria, Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal. AMPAVE-CONASA. , 83-105 (2015).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Adolph, C., et al. Diagnostic strategies to reveal covert infections with intestinal helminths in dogs. Veterinary Parasitology. 247, 108-112 (2017).
- Cringoli, G., Rinaldi, L., Maurelli, M. P., Utzinger, J. FLOTAC: New multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols. 5 (3), 503-515 (2010).
- Katagiri, S., Oliveira-Sequeira, T. C. Comparison of three concentration methods for the recovery of canine intestinal parasites from stool samples. Experimental Parasitology. 126 (2), 214-216 (2010).
- Rehbein, S., Lindner, T., Visser, M., Winter, R. Evaluation of a double centrifugation technique for the detection of Anoplocephala eggs in horse faeces. Journal of Helminthology. 85 (4), 409-414 (2011).
- Liccioli, S., et al. Sensitivity of double centrifugation sugar fecal flotation for detecting intestinal helminths in coyotes (Canis latrans). Journal of Wildlife Diseases. 48 (3), 717-723 (2012).
- Rishniw, M., Liotta, J., Bellosa, M., Bowman, D., Simpson, K. W. Comparison of 4 Giardia diagnostic tests in diagnosis of naturally acquired canine chronic subclinical giardiasis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 24 (2), 293-297 (2010).
- Barutzki, D., Schaper, R. Endoparasites in dogs and cats in Germany 1999-2002. Parasitology Research. 90, S148-S150 (2003).
- Carlin, E. P., Tyungu, D. L. Toxocara: Protecting pets and improving the lives of people. Advances in Parasitology. 109, 3-16 (2020).
- Saari, S., NaReaho, A., Nikander, S. Canine parasites and parasitic diseases. , Academic Press. (2019).
- Bowman, D. D., Montgomery, S. P., Zajac, A. M., Eberhard, M. L., Kazacos, K. R. Hookworms of dogs and cats as agents of cutaneous larva migrans. Trends in Parasitology. 26 (4), 162-167 (2010).
- Dryden, M. W., Payne, P. A., Ridley, R., Smith, V. Comparison of common fecal flotation techniques for the recovery of parasite eggs and oocysts. Veterinary Therapeutics. 6 (1), 15-28 (2005).
- Barutzki, D., Schaper, R. Results of parasitological examinations of faecal samples from cats and dogs in Germany between 2003 and 2010. Parasitology Research. 109, S45-S60 (2011).
- Novobilský, A., Novák, J., Björkman, C., Höglund, J. Impact of meteorological and environmental factors on the spatial distribution of Fasciola hepatica in beef cattle herds in Sweden. BMC Veterinary Research. 11, 128 (2015).
- Pickles, R. S., Thornton, D., Feldman, R., Marques, A., Murray, D. L. Predicting shifts in parasite distribution with climate change: A multitrophic level approach. Global Change Biology. 19 (9), 2645-2654 (2013).
- Pérez-Rodríguez, A., De La Hera, I., Fernández-González, S., Pérez-Tris, J. Global warming will reshuffle the areas of high prevalence and richness of three genera of avian blood parasites. Global Chaneg Biology. 20 (8), 2406-2416 (2014).
- Nava-Castro, K., Hernández-Bello, R., Muñiz-Hernández, S., Camacho-Arroyo, I., Morales-Montor, J. Sex steroids, immune system, and parasitic infections: Facts and hypotheses. Annals Of The New York Academy Of Sciences. 1262, 16-26 (2012).
- Morales-Montor, J., Escobedo, G., Vargas-Villavicencio, J. A., Larralde, C. The neuroimmunoendocrine network in the complex host-parasite relationship during murine cysticercosis. Current Topics in Medicinal Chemistry. 8 (5), 400-407 (2008).
- Olave-Leyva, J., et al. Prevalencia de helmintos gastrointestinales en perros procedentes del servicio de salud de Tulancingo, Hidalgo. Abanico Veterinario. 9 (1), 1-10 (2019).
