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Bioengineering

Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Abstract

O encapsulamento tridimensional (3D) de esferoides é crucial para replicar adequadamente o microambiente tumoral para um ótimo crescimento celular. Aqui, projetamos um modelo in vitro de glioblastoma 3D para encapsulamento esferoide para mimetizar o microambiente extracelular tumoral. Primeiro, formamos moldes de micropoços piramidais quadrados usando polidimetilsiloxano. Esses moldes de micropoços foram então usados para fabricar esferoides tumorais com tamanhos rigidamente controlados de 50-500 μm. Uma vez formados, os esferoides foram colhidos e encapsulados em hidrogéis à base de polietilenoglicol (PEG). Os hidrogéis de PEG são uma plataforma versátil para encapsulamento esferoide, pois as propriedades do hidrogel, como rigidez, degradabilidade e adesividade celular, podem ser ajustadas independentemente. Aqui, usamos um hidrogel macio representativo (~8 kPa) para encapsular esferoides de glioblastoma. Finalmente, um método para coloração e imagem de esferoides foi desenvolvido para obter imagens de alta qualidade via microscopia confocal. Devido ao núcleo esferoide denso e à periferia relativamente escassa, a obtenção de imagens pode ser difícil, mas o uso de uma solução de clareamento e corte óptico confocal ajuda a aliviar essas dificuldades de imagem. Em resumo, mostramos um método para fabricar esferoides uniformes, encapsula-los em hidrogéis de PEG e realizar microscopia confocal nos esferoides encapsulados para estudar o crescimento esferoide e várias interações célula-matriz.

Introduction

Os esferoides tumorais têm emergido como ferramentas úteis in vitro no estudo da etiologia, patologia e responsividade a drogasdo câncer 1. Tradicionalmente, esferoides têm sido cultivados em condições como placas de baixa adesão ou biorreatores, onde a adesão célula-célula é favorecida em relação à adesão célula-superfície2. No entanto, é hoje reconhecido que, para recapitular o microambiente tumoral com mais fidelidade, modelos esferoides in vitro devem capturar tanto as interações célula-célula quanto célula-matriz. Isso levou vários grupos a projetar arcabouços, como hidrogéis, onde esferoides podem ser encapsulados 3,4. Tais modelos esferoides baseados em hidrogel permitem a elucidação de interações célula-célula e célula-matriz sobre vários comportamentos celulares, tais como viabilidade, proliferação, tronco ou responsividade à terapia3.

Aqui, descrevemos um protocolo para encapsulação de esferoides de glioblastoma em hidrogéis de polietilenoglicol (PEG). Existem vários relatos na literatura de encapsulamento esferoide de células de glioblastoma em hidrogéis. Por exemplo, esferoides foram formados encapsulando células U87 em hidrogéis de PEG decorados com um ligante adesivo RGDS e reticulados com um peptídeo enzimaticamente clivável para determinar o efeito da rigidez do hidrogel no comportamento celular5. Células U87 também foram formadas em outros hidrogéis à base de PEG ou ácido hialurônico para expandir a população de células-tronco cancerígenas6 ou explorar mecanismos mediados pela matriz de resistência à quimioterapia 7,8,9. Esferoides de glioblastoma também têm sido encapsulados em hidrogéis de gelatina para estudar o crosstalk entre micróglia e células cancerosas e seu efeito na invasão celular10. Em geral, tais estudos têm demonstrado a utilidade de modelos in vitro baseados em hidrogel na compreensão da patologia do glioblastoma e na elaboração de tratamentos.

Além disso, existem diferentes métodos para a fabricação de esferoides tumorais e encapsulamento de hidrogel11. Por exemplo, células dispersas poderiam ser semeadas em hidrogéis e deixadas formar esferoides ao longo do tempo 5,12. Uma desvantagem de tal método é a polidispersidade dos esferoides formados, o que poderia levar a respostas celulares diferenciais. Para produzir esferoides uniformes, as células poderiam ser encapsuladas em microgéis e cultivadas por longos períodos até invadirem e remodelarem o gel13, ou as células poderiam ser depositadas em géis moldados com "furos" esféricos e deixadas agregar14. A desvantagem desses métodos é sua relativa complexidade, a necessidade de um gerador de gotículas ou outros meios para formar microgéis ou os "buracos" no gel, e o tempo que leva para os esferoides crescerem e amadurecerem. Alternativamente, os esferoides poderiam ser pré-formados em micropoços 9,15,16 ou em placas suspensas17,18 e então encapsulados em hidrogel, semelhante à técnica aqui descrita. Esses métodos são mais simples e podem ser feitos de uma forma de maior rendimento. Curiosamente, tem sido demonstrado que o método de formação de esferoides pode afetar comportamentos de células esferoides, tais como expressão gênica, proliferação celular ou responsividade a drogas19,20.

Aqui, enfocamos o glioblastoma por se tratar de um tumor sólido cujo ambiente nativo é a matriz cerebral macia e nanoporosa21, que pode ser mimetizada por um hidrogel macio e nanoporoso. O glioblastoma também é o câncer cerebral mais letal para o qual não há cura disponível22. Entretanto, o protocolo aqui descrito pode ser utilizado para o encapsulamento de esferoides representando qualquer tumor sólido. Optou-se por utilizar hidrogéis de PEG que são formados através de uma reação de adição tipo Michael23. O PEG é um hidrogel sintético, não degradável e biocompatível, inerte e serve como andaime e suporte físico celular, mas não suporta a ligação celular23. A adesividade celular pode ser adicionada separadamente via amarração de proteínas inteiras ou ligantes adesivos24, e a degradabilidade pode ser adicionada através de modificações químicas da cadeia polimérica do PEG ou reticulantes hidrolítica ou enzimaticamente degradáveis25,26. Isso permite que as propriedades bioquímicas sejam ajustadas independentemente das propriedades mecânicas ou físicas do hidrogel, o que poderia ser vantajoso no estudo das interações célula-matriz. A química de gelificação do tipo Michael é seletiva e ocorre em condições fisiológicas; Assim, permite o encapsulamento esferoide simplesmente misturando os esferoides com a solução precursora de hidrogel.

De modo geral, a metodologia aqui apresentada tem várias características notáveis. Primeiro, fabricar esferoides tumorais em uma montagem multipoço é eficiente, rápido e o custo dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os esferoides são produzidos em grandes lotes em uma variedade de tamanhos com baixa polidispersidade. Finalmente, apenas materiais disponíveis comercialmente são necessários. A utilidade da metodologia é ilustrada pela exploração do efeito das propriedades do substrato na viabilidade das células esferoides, circularidade e tronco celular.

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Protocol

1. Preparação das soluções

  1. Preparação de solução precursora de polidimetilsiloxano (PDMS)
    1. Preparar a solução precursora negativa de PDMS (também usada para a solução de precursor de cola). Coloque o elastômero em um barco de pesagem usando uma espátula e pese-o. Adicione o agente de cura à base do elastômero na proporção de 1:10. Misture o PDMS e o agente de cura suave e cuidadosamente usando a espátula no barco de pesagem de plástico.
      NOTA: Esta solução precursora de PDMS é despejada na placa de micropoço piramidal quadrada de 6 poços para formar o molde negativo. Esta é a mesma solução que é usada para a solução precursora de cola.
    2. Prepare a solução precursora positiva do PDMS. Coloque a base de elastômero no barco de pesagem usando uma espátula e pese-a. Adicione o agente de cura à base do elastômero na proporção de 1:9. Misture o PDMS e o agente de cura suave e cuidadosamente usando a espátula no barco de pesagem de plástico.
      NOTA: Esta solução precursora de PDMS é posteriormente despejada no molde negativo para formar o molde positivo.
  2. Preparação de tampão 0,3 M de trietanolamina (TEA) pH 8
    1. Pipetar 1 mL de TEA e 9 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x para um cônico de 50 mL usando um auxílio de pipeta para criar uma solução de TEA 0,75 M. Titular a solução até um pH de 8 utilizando 1 N HCl ou 1 N NaOH. Em seguida, adicione 1x PBS suficiente para atingir um volume final de 25 mL para atingir uma concentração final de TEA de 0,3 M com um pH de 8.
      CUIDADO: Armazene as soluções de HCl e NaOH em um armário inflamável à temperatura ambiente (TR). Use equipamentos de proteção individual ao manusear.
  3. Preparação de mídias completas
    1. Para o preparo do meio completo, adicionar 10% (p/v) ou 56 mL de soro fetal bovino e 1% (p/v) ou 5,6 mL de penicilina e estreptomicina a 500 mL de RPMI em meio RPMI.
    2. Colocar a solução a 37 °C durante 10-20 minutos ou até que a solução esteja quente antes de utilizar.
    3. Conservar a solução a 0-4 °C até 6 meses.
  4. Preparação de soluções-estoque de polietilenoglicol (PEG) a 20% (p/v)
    NOTA: O cálculo baseia-se em soluções de 100 μL que podem ser aumentadas ou reduzidas conforme necessário.
    1. Para preparar uma solução-mãe de 100 μL de 20% p/v de 4 braços de PEG-Acrilato (4 braços PEG-Ac), pesar 20 mg de pó de PEG-Ac de 4 braços em um tubo de microfuga. Adicionar 70 μL de tampão TEA 0,3 M e, em seguida, agitar a solução por cerca de 30 s ou até dissolver completamente. Considere a mudança de volume devido à dissolução do pó adicionando tampão TEA suficiente (~27 μL) para atingir um volume final de solução de 100 μL.
    2. Para preparar uma solução-mãe de 100 μL de 20% p/v PEG-diSH, pesar 20 mg de pó de PEG-diSH em um tubo de microfuga. Adicione 70 μL de tampão TEA e, em seguida, agite a solução por cerca de 30 s ou até dissolver completamente. Considere a mudança de volume devido à dissolução do pó adicionando tampão TEA suficiente (~27 μL) para atingir um volume final de solução de 100 μL.
      NOTA: O pó de PEG é muito higroscópico e precisa ser armazenado em um recipiente dessecado a -20 °C. Ao retirá-lo do congelador, deixe o pó de PEG descongelar por 10 minutos antes de abrir o frasco para pesar o pó. Limpe a garrafa com um gás inerte, como nitrogênio ou argônio, para deslocar o ar úmido antes de devolvê-lo ao congelador. A solução-mãe de PEG-Ac de 4 braços pode ser armazenada a 4 °C por até 2 semanas antes do uso. A solução-estoque de PEG-diSH precisa ser preparada imediatamente antes do uso e não pode ser armazenada porque os grupos tióis reagem entre si para formar ligações dissulfeto.
  5. Preparação de solução de matriz de membrana basal a 2% v/v
    1. Para preparar uma solução de trabalho de matriz de membrana basal a 2% v/v, adicione 20 μL da matriz de membrana basal (livre de LDEV) a 9,98 mL de meio completo e misture completamente pipetando para cima e para baixo ~10 vezes. Preparar a solução a 4 °C (no gelo), depois aquecê-la a 37 °C (num forno ou incubadora) e utilizar imediatamente.
      NOTA: A matriz da membrana basal começará a formar um gel a >10 °C, portanto, certifique-se de misturar a solução da matriz da membrana basal com o meio completo a 2-6 °C. A composição completa dos meios é descrita na etapa 1.3.
  6. Preparação da solução fixadora celular
    1. Para preparar 1 mL de solução fixadora celular contendo 4% p/v de paraformaldeído e 0,1% v/v de surfactante não iônico, primeiro misturar 891 μL de 1x PBS e 108 μL de paraformaldeído (concentração de 37% p/v) e, em seguida, adicionar 1 μL de tensoativo não iônico (concentração de 100%). Misture bem a solução.
      NOTA: A solução fixadora deve ser renovada sempre que a fixação for realizada.
      CUIDADO: O paraformaldeído é inflamável e pode formar concentrações de poeira combustível no ar. Causa irritação da pele e danos oculares graves. Evite respirar, pois pode causar irritação respiratória. Manuseie o paraformaldeído em um exaustor químico e use equipamentos de proteção individual. Lave bem as mãos após o manuseio. O surfactante não iônico causa irritação da pele e danos oculares graves. Use luvas de proteção e proteção ocular ou facial ao manusear. Para evitar a liberação no meio ambiente, abra a garrafa em uma coifa de fumaça química. Lave bem as mãos após o manuseio.
  7. Preparo das soluções corantes
    1. Para preparar 3 mM de iodeto de 3,3'-dihexiloxacarbocianina (DiOC), misturar 2,65 mg de DiOC em 1 mL de DMSO.
    2. Para preparar 1,5 mM de solução de iodeto de propídio (PI), misturar 1 mg de IP em 1 mL de água desionizada.
  8. Preparação da solução de depuração esferoide
    1. Preparar soluções de limpeza de 20%, 40% e 80% v/v de formamida em 1x PBS para limpeza esferoide.
      1. Para fazer 10 mL de formamida 20% v/v, misturar 8 mL de 1x PBS seguido de 2 mL de formamida. Para fazer 10 mL de formamida 40% v/v, misturar 6 mL de 1x PBS seguido de 4 mL de formamida. Para fazer 10 mL de formamida a 80% v/v, misturar 2 mL de 1x PBS seguido de 8 mL de formamida.
      2. Depois de combinar formamida e 1x PBS, misture a solução por vórtice por cerca de 30 s.

2. Fabricação de micropoços piramidais quadrados

  1. Fabricar molde PDMS negativo de micropoços piramidais quadrados como mostrado na Figura 1.
    1. Prepare 2 g (~1 mL) de solução precursora de PDMS negativa e despeje-a em um poço de um molde mestre piramidal quadrado de 6 poços. Observe que 1 mL cobre completamente um poço da placa. Depois de cobrir o molde mestre com PDMS, desgaseifique a solução precursora de PDMS por 30 minutos colocando a placa piramidal quadrada de 6 poços em um dessecador a vácuo. Em seguida, cure o PDMS colocando a placa em um forno de 60 °C por 24 h.
      NOTA: Certifique-se de que a tampa da placa é removida para desgaseificação e colocada novamente para cura. Desgaseifique a solução em um exsicador a vácuo ou através de purga com um gás inerte, como nitrogênio ou argônio. Se a solução precursora do molde negativo ainda apresentar bolhas após 30 min, indicando desgaseificação inadequada, coloque-a em um exsicador a vácuo por mais 30 min. Use um ou vários poços de placa simultaneamente para preparar um ou mais moldes negativos de PDMS. Micropoços piramidais quadrados de diferentes tamanhos podem ser usados, como comprimentos laterais de 400 e 800 μm, como mostra a Tabela 1. A mesma quantidade de PDMS é usada independentemente dos tamanhos piramidais quadrados.
    2. Uma vez que o PDMS cura ainda quente, remova cuidadosamente o molde PDMS negativo do molde mestre usando uma espátula e corte o molde negativo em uma laje de 35 mm de diâmetro usando um punch de biópsia. Coloque em uma placa de Petri e cubra com a tampa e deixe a cura contínua por mais 24 h.
      NOTA: Para remover os moldes negativos, use uma espátula para ficar entre a placa do poço e o molde PDMS e puxe suavemente o molde negativo do molde mestre. O molde é cortado em placas de 35 mm para encaixar uma placa de Petri de 35 mm. Os moldes podem ser feitos em outros tamanhos para encaixar chapas de diferentes diâmetros. As placas negativas de molde de 35 mm podem ser armazenadas, protegidas da poeira em RT e reutilizadas por 6 meses.
  2. Preparar molde PDMS positivo de micropoços piramidais quadrados.
    1. Coloque as placas de 35 mm do molde negativo do PDMS em uma placa de Petri de 35 mm com os micropoços texturizados voltados para cima.
    2. Prepare 2,5 g (~1,2 mL) de solução precursora de PDMS positiva como acima e despeje-a sobre o molde negativo na placa de Petri de 35 mm para cobrir completamente o molde negativo. Em seguida, desgaseifique a solução precursora por 30 min como acima e coloque-a em forno a 60 °C por 3-4 h.
      NOTA: Como o PDMS é viscoso, uma bolha pode se formar a partir do ar preso sob o molde negativo. Se uma bolha se formar sob o molde negativo, empurre o molde suavemente para baixo usando uma espátula para liberar a bolha. Se as bolhas de ar permanecerem, continue desgaseificador por 30 min, ou pegue uma espátula e mexa suavemente a solução do molde positivo até que as bolhas estourem.
    3. Uma vez curado o molde PDMS positivo, remova os moldes da placa de Petri de 35 mm e descasque imediatamente o molde positivo do molde negativo.
      NOTA: O tempo é importante para o sucesso do descascamento do molde positivo. A remoção é melhor feita cortando ligeiramente o molde positivo usando uma navalha para expor a interface entre o molde positivo e negativo e descascando os moldes uns dos outros. Em seguida, descasque as bordas do molde circular. Descasque suavemente o molde negativo do molde positivo.
  3. Cole os moldes no fundo dos poços de uma placa de 48 poços.
    NOTA: Aqui, uma placa de 48 poços é usada, mas outras placas podem ser usadas desde que as placas do molde sejam cortadas nos diâmetros corretos (por exemplo, 6 mm de diâmetro para uma placa de 96 poços).
    1. Corte os moldes positivos em placas usando um punch de biópsia de 10 mm.
      NOTA: Aproximadamente 4 moldes (cada um com 10 mm de diâmetro) podem ser cortados a partir de um molde positivo de 35 mm de diâmetro.
    2. Para colar os moldes no fundo de uma placa de 48 poços, prepare a solução precursora de cola PDMS (~0,5 mL ou 1 g), conforme descrito anteriormente27. Use uma pinça para mergulhar suavemente o lado plano (não o lado com o padrão de micropoços) do molde positivo de 10 mm na solução precursora do PDMS. Coloque cuidadosamente um molde por poço de uma placa de 48 poços e pressione suavemente cada molde no fundo do poço usando o tweezer. Coloque a placa montada em um forno de 60 °C por 4-24 h para permitir que a cola PDMS cure.
      NOTA: Se a solução precursora de cola PDMS entrar nos micropoços de molde positivos, ela pode ser limpa usando papel de tecido macio e a etapa pode ser repetida. Ao colar, certifique-se de que a cola não cubra os micropoços.
    3. Esterilizar moldes adicionando 300 μL de etanol 70% em cada poço da placa de 48 poços usando uma pipeta de 1000 μL. Aspirar o etanol a 70% e colocar a placa de 48 poços descoberta em uma capela de cultura de tecidos sob UV (302 nm) por 2 h.
      NOTA: Os moldes podem ser usados por 6 meses e re-esterilizados conforme a necessidade.

3. Formação, colheita e encapsulamento de esferoides tumorais multicelulares em hidrogéis

NOTA: O protocolo descrito nesta seção é para a linhagem celular de glioblastoma humano U87 (ver Figura 1 e Figura 2), mas um protocolo semelhante poderia ser usado com outros tipos de células cancerosas.

  1. Formação esferoide tumoral multicelular
    1. Lave primeiro os moldes de micropoços com uma solução de enxágue antiaderente, adicionando 300 μL da solução a cada poço usando uma pipeta de 1000 μL. Em seguida, centrifugar a 1620 x g por 3 min e aspirar a solução usando uma bomba de vácuo e uma pipeta de Pasteur.
      Observação : execute esta etapa imediatamente antes da propagação de célula.
    2. Expor as células a ~80 μL de tripsina/EDTA a 0,25% por cada cm2 da área do frasco de cultura durante 5 min a 37 °C. Por exemplo, 1 mL de tripsina/EDTA é apropriado para um frasco de cultura de células T-25. Neutralizar a tripsina adicionando o mesmo volume de meio de cultura celular completo. Por exemplo, adicionar 1 mL de meio completo ao balão de cultura de células T-25 contendo tripsina. Recolher as células do balão de cultura de tecidos.
    3. Transferir 10 μL da suspensão celular para cada porta de um hemocitômetro para contagem celular. Use um microscópio invertido para contar o número total de células e fazer a média dessa contagem de células a partir de pelo menos 8 quadrantes, garantindo que o número de células em cada quadrante do hemocitômetro seja de 20-50 para bons resultados de contagem de células. Multiplique o número calculado por 104 para determinar a concentração celular final.
    4. Ressuspender as células coletadas em meio de cultura de células RPMI completo suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina na concentração final desejada das células, dependendo do tamanho esferoide desejado, como mostra a Tabela 1.
      NOTA: Os micropoços de 800 μm produzirão ~75 esferoides em um poço de uma placa de 48 poços, e os micropoços de 400 μm produzirão ~300 esferoides em um poço de uma placa de 48 poços.
    5. Colocar 500 μL de suspensão celular na concentração desejada em micropoços e centrifugar a placa a 1620 x g por 3 min. Colocar a placa numa incubadora humidificada a 37 °C e 5% CO2 durante 24 h para permitir a formação de esferoides.
      NOTA: Se os esferoides não se formarem, 2% v/v da matriz da membrana basal combinada com meios completos pode ser usada para ressuspender as células (mais detalhes na etapa 1.5).
  2. Colheita de esferoides
    1. Usando uma pipeta de 1000 μL, pipete firmemente 500 μL de meio completo para o poço. Usando 500 μL de meio do poço, lave os quatro quadrantes do poço (especificamente os quadrantes superior, inferior, esquerdo e direito) pipetando para cima e para baixo nos quadrantes três a quatro vezes para desalojar os esferoides. Aspirar suavemente o meio que contém os esferoides (~1000 μL no total) para um tubo de microcentrífuga usando uma pipeta de 1000 μL e deixar que os esferoides se depositem no fundo.
    2. Retire o sobrenadante e ressuspenda os esferoides até a concentração final desejada. Por exemplo, para obter ~8 esferoides em um gel de 20 μL após o encapsulamento, ressuspenda os esferoides em 100 μL de meio, produzindo uma concentração esferoide de ~75 esferoides/100 μL na suspensão esferoide.
  3. Encapsulamento de esferoides em hidrogéis, como mostra a Figura 2.
    1. Para criar 100 μL de uma solução precursora de hidrogel de PEG a 10% p/v, combine 50 μL da suspensão esferoide, seguido por 30 μL de PEG-Ac de 4 braços a 20% p/v e, finalmente, 20 μL de 20% p/v PEG-diSH em um tubo de microcentrífuga. Isso dará uma razão molar estequiométrica dos grupos acrilato (Ac) para tiol (SH), garantindo uma ótima reticulação. Misture a solução precursora de gel pipetando para cima e para baixo ~10 vezes.
      NOTA: A composição, o volume e a concertação do polímero do hidrogel podem ser alterados conforme necessário. Os hidrogéis resultantes serão lentamente degradantes e adesivos não celulares. Para fazer a célula de hidrogel adesiva, um ligante adesivo como RGDS pode ser adicionado. Para tornar o hidrogel enzimaticamente degradável, um reticulante peptídico enzimaticamente degradável contendo resíduos de cisteína em ambas as extremidades poderia ser adicionado. Ao transferir esferoides, pipetar suavemente a solução duas vezes para desalojar os esferoides e colocá-los em suspensão para garantir uma distribuição uniforme dos esferoides.
    2. Pipetar 20 μL da solução precursora de gel entre duas lâminas de vidro revestidas de parafilme separadas com espaçadores de silicone de 1 mm e colocar as lâminas com solução precursora de gel em incubadora a 37 °C, CO2 a 5% durante 15 minutos para permitir a gelificação.
      NOTA: Certifique-se de que as duas lâminas de vidro estejam cobertas de parafilme para criar uma superfície hidrofóbica que permita um descamação fácil após a gelificação. Em vez de parafilme, uma solução de revestimento hidrofóbico pode ser usada. Um volume de 20 μL de solução precursora de hidrogel resultará em uma placa de hidrogel de ~6 mm de diâmetro e 1 mm de altura antes do inchaço. Qualquer tipo e espessura de espaçador pode ser usado, mas recomenda-se que a espessura do gel seja mantida em ou abaixo de 1 mm (hidrogéis mais espessos podem limitar a difusão de oxigênio e o transporte de nutrientes para as células), mas maior do que o diâmetro esferoide (para que os esferoides sejam completamente encapsulados no gel). Qualquer volume da solução precursora de hidrogel pode ser usado. Os géis de 20-30 μL são adequados para uma placa de 24 poços.
    3. Quando a gelificação do hidrogel estiver completa, separe as duas lâminas de vidro e descasque suavemente os géis da placa de vidro usando uma espátula. Coloque os géis em uma placa de 24 poços, um por poço, garantindo que a superfície que contém os esferoides fique voltada para cima.
      NOTA: Os esferoides cairão no fundo do gel durante a gelificação, portanto, invertê-los para cultivo garantirá que os esferoides estejam perto da superfície do hidrogel para melhor acesso a nutrientes e oxigênio. A gelificação pode ser monitorada observando qualquer solução precursora de hidrogel remanescente no tubo de microcentrífuga e não usada para criar lajes, invertendo o tubo e observando o tempo em que o gel para de fluir.
    4. Adicione meio completo (~500 μL) a cada poço e certifique-se de que o hidrogel está completamente submerso. Colocar a placa multipoço em estufa umidificada a 37 °C e 5% CO2 e cultivar as células com trocas de meio a cada 2-3 dias.
      OBS: Os hidrogéis podem ser cultivados por até 4 semanas ou até que os hidrogéis se degradem, trocando o meio a cada dois dias.

4. Coloração fluorescente

  1. Viabilidade celular
    1. Utilizar a coloração iodeto de 3,3'-dihexiloxacarbocianina (DiOC), que cora a mitocôndria e o retículo endoplasmático de todas as células, para determinar a viabilidade celular. Utilizar DiOC (3 mM) na concentração de 0,02 μg/mL. Especificamente, utilizar uma pipeta de 20 μL para adicionar 2 μL de DiOC por cada 1000 μL de meio no balão de cultura das células dissociadas (pelo menos 24 h antes do processo de formação dos esferoides na secção 3). Aguarde 24 h para que o DiOC core as células.
    2. Utilizar a coloração nuclear e cromossômica, iodeto de propídio, PI (1,50 mM), que entra apenas em células mortas. Para manchar as células, primeiro aspirar todos os meios e enxaguar o gel usando uma pipeta de 1000 μL para adicionar 500 μL de 1x PBS para que o gel fique completamente submerso.
    3. Aspirar o PBS e adicionar 500 μL de meio fresco, seguido de 30 μL da solução de IP em cada poço (ou seja, 6 μL por cada 100 μL de meio). Cubra a placa do poço com papel alumínio para protegê-la da luz. Coloque a placa do poço em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2 e aguarde 30 minutos para que o IP core as células mortas.
    4. Retire a folha e aspirar o meio dos poços. Use uma pipeta de 1000 μL para adicionar 500 μL de 1x PBS para submergir o hidrogel. Aspirar o PBS 1x e repetir o enxágue mais duas vezes. Adicionar 500 μL de meio a cada poço e obter imagens em microscópio fluorescente invertido ou confocal.
    5. Calcular a viabilidade celular comparando a área de DiOC (todas as células) com PI (células mortas), conforme representado na equação 1, usando imagens z-stack de um microscópio confocal ou de um microscópio fluorescente invertido.
      Equation 1 Eq. 1º.

5. Fixação, coloração, clareamento e imagem por imunofluorescência de esferoides encapsulados

  1. Fixação e coloração
    1. Aspirar o meio dos poços onde os hidrogéis são cultivados e enxaguar os hidrogéis pipetando 500 μL de 1x PBS diretamente sobre os hidrogéis. Aspirar suavemente o PBS 1x.
    2. Fixar os esferoides na placa de 24 poços usando uma pipeta de 1000 μL para adicionar 500 μL de volume de solução fixadora por poço. Deixe o fixador de molho por 30 min no RT. Retire a solução fixadora usando uma pipeta de 1000 μL e descarte em um recipiente de resíduos designado.
    3. Enxágue os hidrogéis adicionando 500 μL de 1x PBS a cada poço. Aspirar o PBS 1x usando uma pipeta de 1000 μL e repetir o enxágue PBS duas vezes adicionais. Conservar a placa do poço em 500 μL de 1x PBS por poço a 4 °C durante até 1 semana ou utilizar imediatamente.
      NOTA: Tenha cuidado para não puxar os hidrogéis para dentro da pipeta ao aspirar PBS e solução fixadora. Faça isso inclinando a placa para um ângulo de ~45 graus, o que ajudará a ver os hidrogéis e evitar a aspiração acidental.
      CUIDADO: O formaldeído é tóxico por inalação e contato. Manuseie com luvas em um exaustor de fumaça química.
    4. Para corar as células, incubar os esferoides encapsulados em hidrogel com anticorpos primários para Nestin (200 μg/mL) e SOX2 (200 μg/mL) em uma diluição de 1:200 de anticorpo: PBS. Use uma pipeta de 1000 μL para aspirar o PBS 1x dos poços. Adicionar 50 μL do anticorpo diluído a cada poço. Aguarde 24 h para que a coloração seja completada. Em seguida, remova a solução corante usando uma pipeta de 1000 μL e descarte os resíduos adequadamente.
    5. Use uma pipeta de 1000 μL para adicionar 500 μL de 1xPBS, o que é suficiente para submergir o hidrogel. Aspirar a EEP e repeti-la mais duas vezes. Armazenar o hidrogel corado e submerso em 1x PBS a 4 °C por até 2 semanas antes da aquisição de imagens ou imagens imediatamente.
      NOTA: Pequenas otimizações podem ser necessárias dependendo do anticorpo para garantir a coloração adequada. A concentração (1:200) e o tempo (24 h) são significativamente maiores do que na cultura de células monocamada 2D típica, pois a coloração 3D requer difusão através do hidrogel e dos esferoides.
  2. Depois de colorir os esferoides, limpe o esferoide para melhorar a transparência da imagem, substituindo o PBS por um aumento sequencial da concentração de formamida (opcional).
    1. Aspirar o PBS 1x de cada poço. Adicionar 500 μL de formamida a 20% (v/v) em cada poço e deixar o hidrogel incubar por 90 min. Aspirar a formamida utilizando uma pipeta de 1000 μL e recolher os resíduos num recipiente de resíduos.
    2. Adicionar 500 μL de formamida a 40% (v/v) ao poço. Deixe o hidrogel incubar na solução durante 90 minutos. Aspirar a formamida e recolher os resíduos no contentor de resíduos.
    3. Adicionar 500 μL de formamida 80% v/v a cada poço e incubar por 90 min. Aspirar a formamida e descartar no recipiente de resíduos. Adicionar 500 μL de 100% (v/v) de formamida e permitir 24 h de incubação antes da aquisição de imagens. Quando a limpeza estiver concluída, descarte corretamente os resíduos de formamida através dos serviços apropriados de um sistema de gerenciamento de resíduos de laboratório.
      NOTA: A limpeza permite imagens confocais no núcleo do esferoide e é opcional se apenas a periferia do esferoide estiver sendo investigada.
  3. Imagem de esferoides encapsulados em hidrogel usando microscopia confocal.
    NOTA: Qualquer microscópio - invertido, fluorescente ou confocal - pode ser usado para imagens celulares; no entanto, o confocal permite o isolamento de planos únicos.
    1. Coloque os hidrogéis em poços com câmaras com fundos de vidro e posicione os esferoides o mais próximo possível da lamínula.
      NOTA: Podem ser utilizadas lamínulas de vidro ou poços com tampas de vidro. É crucial manter os hidrogéis hidratados, pois amostras desidratadas resultarão em baixa qualidade de imagem.
    2. Fotografe as amostras com uma objetiva de longa distância de trabalho (10x-20x) para permitir imagens profundas no esferoide usando pilhas Z para reconstruções 3D.
      NOTA: Objetivos de ampliação mais altos permitem imagens mais detalhadas e seccionamento óptico, mas sacrificam a profundidade da imagem.
    3. Quantifique a quantidade de sinal presente na seção óptica em relação à área total do esferoide para o sinal limpo e não limpo usando a equação 2.
      Equation 2 Eq. 2

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Representative Results

Plataformas de triagem de fármacos baseadas em esferoides para estudar os efeitos quimioterápicos são cada vez mais procuradas devido à ênfase na modulação do microambiente tumoral sobre o encapsulamento esferoide em biomateriais replicantes de tecido nativo. Aqui desenvolvemos um método para preparação de esferoides tumorais multicelulares e posterior encapsulamento e imageamento em hidrogel 3D. Os esferoides são preparados em moldes de micropoços (Figura 3A,B), que resultam em esferoides com formas esféricas e polidispersidade rigidamente controlada. Por exemplo, para esferoides com 3.300 células por micropoço, o tamanho esferoide médio foi de ~250 μm, e circularidade foi de >0,8, onde 1 é uma esfera perfeita (Figura 3C,D). O coeficiente de variância percentual (%CV) para diâmetro esferoide foi de 19,3% e %CV para circularidade foi de 4,5%. Os diâmetros esferoides foram dependentes do número de células por micropoço, como mostra a Tabela 1. Observe que algumas células nos micropoços podem não ser incorporadas no esferoide e serão lavadas durante a etapa de coleta do esferoide.

O esferoide é capaz de ser fotografado em diferentes profundidades de pilha Z, permitindo a viabilidade celular para cada local dentro da pilha Z (Figura 4). Observe que, devido às limitações de imagem confocal e à alta densidade celular, o núcleo esferoide não pôde ser totalmente fotografado. Como discutido mais adiante, a limpeza ou secção esferoide pode ser necessária para melhorar a imagem em todo o esferoide. Através deste método, a viabilidade esferoide foi determinada como alta (~90%) imediatamente após a colheita e encapsulamento, embora a viabilidade celular tenha diminuído ligeiramente para 85% no núcleo esferoide em comparação com a periferia. Para garantir a viabilidade em todo o esferoide, os esferoides foram dissociados usando acutase, e a viabilidade das células dissociadas foi calculada usando o mesmo método e encontrada para ser igualmente alta (>90%). Uma projeção máxima utilizando a pilha esferoide representa o ponto mais alto de intensidade de luz dentro de cada local da pilha Z compactada em uma imagem (Figura 4B).

Imagens representativas de esferoides flutuantes (sem gel) e esferoides encapsulados (gel de PEG) corados para os marcadores de haste Nestin e SOX2 são mostradas na Figura 5. A nestina é um filamento intermediário e um marcador de células-tronco presente nos gliomas. SOX2 é um fator de transcrição para auto-renovação, também presente em gliomas. SOX2 foi co-localizado com DAPI no núcleo, enquanto Nestin estava presente em todas as células. Os dados não mostram diferença entre as condições de gel e sem gel, possivelmente devido ao gel de PEG aqui utilizado ser inerte e não facilitar as interações célula-matriz através da sinalização de integrinas.

Uma das principais limitações da imagem é a alta densidade esferoide, dificultando a obtenção de imagens no núcleo esferoide. Métodos comuns para obter imagens do núcleo esferoide incluem seccionar e limpar as seções. Isso pode funcionar bem com esferoides flutuantes, mas a seccionação de hidrogéis é difícil, e a maioria das limpezas de tecido envolve amostras desidratadas, o que resulta em amostras deformadas. Aqui adaptamos um protocolo de Kuwajima et al.28 para amostras de hidrogel para manter a estrutura esferoide enquanto ainda limpávamos os esferoides. Para demonstrar a utilidade do método de clareamento, os esferoides foram fixados, corados com IP e clareados (Figura 6). A Figura 6A mostra imagens representativas de seções ópticas a ~90 μm em esferoides limpos e não limpos e a área total do esferoide quando a área esferoide é preenchida. Quando o clareamento foi realizado, o núcleo esferoide pôde ser fotografado ~30 μm mais profundo, em comparação com um esferoide não limpo (Figura 6B). O clareamento pode ser muito benéfico para a imunofluorescência, uma vez que a organização espacial dos biomarcadores pode ser analisada no núcleo dos esferoides. Este método só pode ser usado para amostras fixas, pois a integridade da membrana é interrompida.

Figure 1
Figura 1: Fabricação do molde PDMS e formação do esferoide. Soluções precursoras de PDMS são adicionadas a placas de micropoços piramidais quadrados para formar moldes de PDMS. A suspensão de células dissociadas é adicionada aos moldes de PMDS formados e girada para baixo para permitir a formação de esferoides após 24 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Encapsulamento, cultivo e aquisição de imagens de hidrogel. (A) PEG-Ac, PEG diSH e suspensão esferoide de 4 braços são combinados em um tubo de microcentrífuga e (B) misturados bem por pipetagem para cima e para baixo para formar uma solução precursora de gel. (C) 20 μL da solução precursora de gel são pipetados em uma lâmina de vidro, e uma segunda lâmina de vidro é colocada sobre a solução e separada por espaçadores de 1 mm. (D) O hidrogel é transferido para placas de 24 poços com esferoides voltados para cima e é coberto com meio (500 μL). (E) O hidrogel é transferido para uma lamínula de vidro para obtenção de imagens de microscopia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Formação de esferoides em micropoços antes da colheita, 24 h após a semeadura celular inicial nos micropoços. (A) Esferoides em micropoços corados com DiOC (Verde). A barra de escala é de 200 μm. (B) Imagem de campo brilhante de esferoides em micropoços. (C) Histograma do diâmetro esferoide em micropoços. (D) Histograma da circularidade esferoide em micropoços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagem confocal representativa Z-stack do esferoide vivo para análise de mortos vivos. (A) Imagens de 4 fatias de Z-stack com DiOC (verde) e PI (vermelho). A barra de escala é de 200 μm. (B) Projeção máxima do Z-Stack. (C) Viabilidade celular em função da profundidade esferoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Imunomarcação com nestina e SOX2 de esferoides U87 de células U87 flutuantes (sem gel) e encapsuladas em hidrogel (gel de PEG) no dia 5 de cultura. Imagens confocais representativas dos esferoides confirmam a expressão de Nestin (vermelho) e SOX2 (verde), que foram contracorados com DAPI (azul; núcleo). A barra de escala é de 100 μm. Imagens recortadas e ampliadas do quadrado branco mostram a relação entre o núcleo (azul) e SOX2 (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Profundidade de imagem dos esferoides eliminados. (A) Imagens representativas de esferoides fotografadas a 91,6 μm na área esferoide e esferoide total. (B) Porcentagem da área esferoide fotografada à medida que a profundidade aumenta no esferoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tamanho do micropoço (μm) Número de células por esferoide Número de células por poço Concentração Celular (células/mL) Diâmetro esferoide (μm)
400 200 120000 240000 115.4 ± 13.5
500 300000 600000 144,6 ± 14,3
1000 600000 1200000 176,5 ± 12,5
800 2000 300000 600000 212,4 ± 15,7
3000 450000 900000 258,9 ± 16,3
4000 600000 1200000 305,7 ± 21,6
5000 750000 1500000 323,4 ± 29,8

Tabela 1: Diâmetro do espióide e tamanho do micropoço. O número calculado de células por esferoide, o número de células por poço de uma placa de 48 poços, a concentração de células e o diâmetro esferoide resultante dependendo do tamanho do micropoço do molde negativo do PDMS.

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Discussion

Modelos esferoides tumorais multicelulares baseados em hidrogel estão sendo cada vez mais desenvolvidos para avançar nas descobertas terapêuticas do câncer11,13,29. Eles são benéficos porque emulam parâmetros-chave do microambiente tumoral de forma controlada e, apesar de sua complexidade, são mais simples e baratos de usar do que os modelos in vivo, e muitos são compatíveis com tecnologias de rastreamento de alto rendimento. Os biomateriais de hidrogel podem ser ajustados para emular a matriz extracelular tumoral e facilitar as interações célula-matriz, e o esferoide (em oposição às células dissociadas) emula as interações célula-célula do tumor nativo. Os hidrogéis sintéticos, como demonstrado aqui, são particularmente vantajosos porque o hidrogel fornece o suporte estrutural desejado e propriedades físicas e mecânicas, enquanto ligantes adesivos ou sequências degradáveis podem ser usados para ajustar independentemente as propriedades bioquímicas do material. Os hidrogéis sintéticos também oferecem menor variabilidade lote a lote e maiores faixas de propriedades do material, abrangendo a maioria dos tecidos moles do corpo.

Aqui, descrevemos em detalhes o uso de um hidrogel inerte à base de PEG que se forma via adição do tipo Michael, como descrito anteriormente25,30. O hidrogel PEG representativo aqui utilizado tem módulo de elasticidade de ~8 kPa, semelhante à rigidez tecidual do glioblastoma9. O hidrogel de PEG é conveniente, pois possui propriedades ajustáveis e química de gelificação altamente específica, podendo ser formado na presença de esferoides sem comprometer a viabilidade celular (Figura 4). Enquanto o hidrogel de PEG é inerte e serve como andaime celular com propriedades físicas e mecânicas definidas, ligantes adesivos celulares podem ser adicionados para guiar interações célula-matriz, e reticulantes peptídicos enzimaticamente degradáveis podem ser adicionados para auxiliar o remodelamento da matriz9. Ligantes adesivos e reticulantes peptídicos podem ser selecionados para emular o microambiente celular e adicionar relevância fisiológica ou patológica ao modelo. Para obter mais detalhes sobre as modificações do hidrogel de PEG para ajustar a degradabilidade, propriedades mecânicas e adesividade do hidrogel, os leitores são consultados no seguinte trabalho publicado 9,27.

Usando o método aqui descrito, grandes quantidades de esferoides cancerígenos podem ser formadas rapidamente e encapsuladas no hidrogel de PEG para explorar o efeito das propriedades do substrato na viabilidade das células esferoides, morfologia ou tronco celular (Figura 4 e Figura 5), entre outras propriedades. As células são primeiramente agregadas e formadas um esferoide e depois encapsuladas nos hidrogéis, como mostram a Figura 2 e a Figura 3. O processo de agregação permite variar os tamanhos esferoides com base no tamanho dos moldes de micropoços e na concentração da suspensão celular pipetada nos moldes de micropoços (Tabela 1). Os esferoides resultantes são relativamente monodispersos em tamanho, com um coeficiente de variância médio de ~10%-20% para todas as condições. Isso é benéfico para uma variedade de aplicações, pois tamanhos semelhantes exibirão limitações de difusão semelhantes, seja de drogas, nutrientes ou oxigênio, no esferoide. Os esferoides também têm uma circularidade de >0,8, que é comparável a outros métodos de fixação ultrabaixa ou queda suspensa31. Note que outros métodos para a formação de esferoides podem ser usados primeiro, como o método de gota suspensa ou sistema de cultura de células rotativas32, e depois encapsulados no hidrogel. No entanto, o método aqui descrito não requer equipamentos especializados ou consumíveis caros, auxiliando, portanto, na acessibilidade para todos os laboratórios.

Enquanto os métodos mostrados aqui usam a linhagem celular de glioblastoma U87-MG, o método de fabricação e encapsulamento esferoide descrito pode ser usado para vários tipos de células cancerosas que formam tumores sólidos. Se as células não se agregam prontamente para formar um esferoide, uma mistura de proteínas da MEC, como uma matriz de membrana basal, pode ser adicionada à suspensão celular para auxiliar o processo (conforme descrito nos métodos). Uma vez que os esferoides são encapsulados, é melhor ser fotografado e analisado diretamente no hidrogel em vez de ser extraído do hidrogel ou as células sendo dissociadas. Isso ocorre porque os esferoides são tipicamente heterogêneos (por exemplo, um núcleo hipóxico pode se formar devido a gradientes de oxigênio e nutrientes), e as respostas celulares serão diferentes com base na posição dentro do esferoide. Além disso, a extração celular pode obscurecer o papel das interações célula-matriz no destino esferoide. Por exemplo, já demonstramos anteriormente que células na periferia esferoide versus núcleo têm responsividade diferente à quimioterápica, o que é ainda dependente das propriedades mecânicas do substrato27. Assim, recomenda-se o uso de técnicas de microscopia para o estudo do comportamento esferoide, como destacado neste manuscrito.

Uma questão a ser considerada ao obter imagens de tecidos densos, como esferoides, é sua opacidade. Descrevemos aqui um método de clareamento para melhorar a imageabilidade através do interior do esferoide (Figura 6). No entanto, embora o clareamento esferoide ajude a maximizar a profundidade da imagem, limitações podem ser encontradas ao colocar os esferoides encapsulados na formamida, resultando em dano estrutural potencial e afetando a imageabilidade esferoide. Este processo também não pode ser realizado quando se observa a viabilidade celular através de coloração viva/morta, pois a limpeza requer fixação. O processo de limpeza também requer várias horas de incubação em formamida após a coloração, de modo que poderia potencialmente impactar os corantes que estão sendo usados. Outras técnicas, como criossecção e imunomarcação, também podem funcionar, desde que o corte não distorça ou comprometa a integridade do tecido esferoide. Em nossas mãos, a criossecção resultou em esferoides "esmagados" devido à maciez do hidrogel, que é ~8 kPa no módulo de Young, para emular a rigidez do tecido de glioblastoma.

Em geral, as etapas críticas neste protocolo são fabricação esferoide bem-sucedida, encapsulamento e cultura de hidrogel e imagem e análise de esferoides; portanto, fornecemos notas e estratégias de solução de problemas para essas etapas. Os esferoides encapsulados em hidrogel aqui descritos podem ser usados em uma variedade de aplicações, tais como plataformas de triagem de fármacos, estudos detalhados de interações célula-matriz e seu efeito sobre o comportamento celular, estudos de etiologia de doenças, etc. Tais estudos podem ser auxiliados pela sintonia do sistema descrito como discutido acima e pelas propriedades previsíveis e controláveis do hidrogel sintético de PEG. Algumas limitações do sistema descrito incluem uma taxa de transferência média, onde a alta taxa de transferência é preferível para estudos multiplex ou de alto volume, como triagem de drogas. Outra limitação é a necessidade de exames de imagem, como imagens confocais, para análise dos dados. Embora as imagens permitam análises especiais e temporais detalhadas, elas também são demoradas e dificultadas por limitações de penetração devido à profundidade e densidade das células esferoides.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya P Zustiak pela Saint Louis University, bem como por uma bolsa semente do Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience da Saint Louis University concedida à Dra. Silviya P Zustiak.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Fisher Scientific  LC22210-4
15 mL Conicals FALCON 352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates Fisher Scientific 07-200-602
35 mm Petri Dish Amazon 706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) Laysan Bio ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals Fisher Scinetific 3181345107
6-well AggreWell 400  StemCell Technologies, Vancouver, Canada 34421 Square pyramidal microwells 
anti-adherence rinsing solution StemCell Technologies, Vancouver, Canada Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Chemical Fume Hood KEWAUNEE 99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free  Corning 356234 Basement membrane matrix
Detergent - Triton-X Sigma Aldrich T8787 Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific  BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Fisher Scinetific 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum HyClone SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution Sigma Aldrich F1635
Glass Plates Slumpys GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes Fisher Scinetific 5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Hemacytometer Bright-Line 383684
Hydrophobic solution - Repel Silane  GE Healthcare Bio-Sciences 17-1332-01
Incubator NUAIRE NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25) Zeiss 663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) Fisher Scientific  D1125
Leica Confocal SP8 Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) Zeiss 3820005619
Micro centrifuge tubes Fisher Scientific 2 mL: 02681258
Microscope Software Zeiss AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594  Santa Cruz Biotechnology sc-23927
Parafilm PARAFILM  PM992
PBS (1x), pH 7.4 HyClone SH30256.01
Penicillin Streptomycin MP Biomedicals 1670046
Pipette Aid Drummond Scientific Co. P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) Fisher Scinetific 2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL) Amazon  mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) Laysan Bio SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] Elsworth Adhesives 3097358-1004 Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves Quest 92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.  Fisher Scientific  AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x) HyClone SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm Grace Bio-Labs JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488  Santa Cruz Biotechnology sc-365823
Tissue Culture Hood NUAIRE NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)  Sigma Aldrich 90279
U-87 MG human glioblastoma cells American Type Culture Collection  HTB-14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  2. Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417 (2018).
  3. Li, Y., Kumacheva, E. Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening. Science Advances. 4 (4), eaas8998 (2018).
  4. Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids. Polymers. 12 (11), 2506 (2020).
  5. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  6. Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).
  7. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).
  8. Pedron, S., et al. Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens. Biomaterials. 219, 119371 (2019).
  9. Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids. Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).
  10. Chen, J. -W. E., et al. Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346 (2020).
  11. Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling. Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980 (2018).
  12. Shin, S., et al. Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation. RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).
  13. Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
  14. Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture. Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).
  15. Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells. PLoS One. 14 (1), e0211078 (2019).
  16. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665 (2013).
  17. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).
  18. Zhao, L., et al. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Scientific Reports. 9 (1), 19717 (2019).
  19. Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
  20. Gencoglu, M. F., et al. Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).
  21. Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. Mechanical properties of brain tissue based on microstructure. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924 (2021).
  22. Alifieris, C., Trafalis, D. T. Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment. Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).
  23. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  24. Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).
  25. Kroger, S. M., et al. Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation. Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085 (2020).
  26. Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration. Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).
  27. Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels. Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).
  28. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  29. Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics. MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).
  30. Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).
  31. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948 (2016).
  32. Lee, K. -H., Kim, T. -H. Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening. Biosensors. 11 (11), 445 (2021).

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Este mês em JoVE Edição 199 Encapsulação Hidrogéis de Polietilenoglicol Estudo Interações Matriz Esferoide Encapsulamento 3D Microambiente Tumoral Crescimento Celular Modelo In Vitro Modelo de Glioblastoma Moldes de Micropoços Piramais Tamanhos Controlados Polidimetilsiloxano Hidrogéis à base de PEG Propriedades do Hidrogel Rigidez Degradabilidade Adesividade Celular Hidrogel Mole Coloração Microscopia Confocal Núcleo Esferoide Periferia Solução de Limpeza
Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz
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Bruns, J., Nejat, S., Faber, A.,… More

Bruns, J., Nejat, S., Faber, A., Zustiak, S. P. Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions. J. Vis. Exp. (199), e65515, doi:10.3791/65515 (2023).

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