Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ייצור מהיר, חזק וזול של ספרואידים סרטניים ואחריו אנקפסולציה הידרוג'ל. זה ישים באופן נרחב כפי שהוא אינו דורש ציוד מיוחד. זה יהיה שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה ובניית פיזיולוגיה של רקמות חוץ גופיות או מודלים פתולוגיים.

Abstract

אנקפסולציה תלת ממדית (3D) של ספרואידים חיונית כדי לשכפל כראוי את המיקרו-סביבה של הגידול לצמיחת תאים אופטימלית. כאן, תכננו מודל גליובלסטומה תלת-ממדי במבחנה עבור אנקפסולציה ספרואידית כדי לחקות את המיקרו-סביבה החוץ תאית של הגידול. ראשית, יצרנו תבניות מיקרווול פירמידליות מרובעות באמצעות polydimethylsiloxane. תבניות מיקרו-באר אלה שימשו לאחר מכן לייצור ספרואידים סרטניים בגדלים מבוקרים היטב בין 50-500 מיקרומטר. לאחר יצירת הספרואידים, הם נקטפו ונעטפו בהידרוג'לים מבוססי פוליאתילן גליקול (PEG). הידרוג'ל PEG הוא פלטפורמה רב-תכליתית לאנקפסולציה ספרואידית, מכיוון שניתן לכוונן תכונות הידרוג'ל כגון קשיחות, מתכלות והיצמדות תאים באופן עצמאי. כאן, השתמשנו בהידרוג'ל רך מייצג (~ 8 kPa) כדי לתמצת ספרואידים של גליובלסטומה. לבסוף, פותחה שיטה להכתמה ותמונה של ספרואידים לקבלת תמונות באיכות גבוהה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בשל הליבה הספרואידית הצפופה והפריפריה הדלילה יחסית, הדמיה יכולה להיות קשה, אך שימוש בתמיסת ניקוי וחתך אופטי קונפוקלי מסייע להקל על קשיי הדמיה אלה. לסיכום, אנו מראים שיטה לייצר ספרואידים אחידים, לעטוף אותם בהידרוג'לים PEG ולבצע מיקרוסקופ קונפוקלי על הספרואידים העטופים כדי לחקור את גדילת הספרואידים ואינטראקציות שונות בין תאים למטריצה.

Introduction

ספרואידים סרטניים התגלו ככלים שימושיים במבחנה בחקר אטיולוגיה של סרטן, פתולוגיה והיענות לתרופות1. באופן מסורתי, ספרואידים גודלו בתרבית בתנאים כגון לוחות הדבקה נמוכים או ביוריאקטורים, שבהם היצמדות התא מועדפת על פני היצמדות פני התא2. עם זאת, כיום ידוע כי כדי לשחזר את המיקרו-סביבה של הגידול בצורה נאמנה יותר, מודלים ספרואידים במבחנה צריכים ללכוד הן אינטראקציות תא-תא והן אינטראקציות מטריצת תאים. זה גרם לקבוצות רבות לתכנן פיגומים, כגון הידרוג'לים, שבהם ניתן לעטוף ספרואידים 3,4. מודלים ספרואידים מבוססי הידרוג'ל כאלה מאפשרים הבהרה של אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים על התנהגויות תאים שונות, כגון כדאיות, התפשטות, גזע או היענות לטיפול3.

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לאנקפסולציה של ספרואידים מסוג גליובלסטומה בהידרוג'לים מפוליאתילן גליקול (PEG). ישנם דיווחים ספרותיים רבים על אנקפסולציה ספרואידית של תאי גליובלסטומה בהידרוג'לים. לדוגמה, ספרואידים נוצרו על ידי עטיפת תאי U87 בהידרוג'ל PEG המעוטרים בליגנד דבק RGDS ומוצלבים עם פפטיד בעל יכולת שבירה אנזימטית כדי לקבוע את ההשפעה של קשיחות הידרוג'ל על התנהגות התא5. תאי U87 נוצרו גם בהידרוג'לים אחרים מבוססי PEG או חומצה היאלורונית כדי להרחיב את אוכלוסיית תאי הגזע הסרטניים6 או לחקור מנגנונים בתיווך מטריצה של עמידות לכימותרפיה 7,8,9. גליובלסטומה ספרואידים היו עטופים גם בהידרוג'לים של ג'לטין כדי לחקור את ההצלבה בין תאי מיקרוגליה ותאים סרטניים ואת השפעתה על פלישת תאים10. בסך הכל, מחקרים כאלה הוכיחו את התועלת של מודלים מבוססי הידרוג'ל במבחנה בהבנת פתולוגיה של גליובלסטומה ובתכנון טיפולים.

יתר על כן, ישנן שיטות שונות לייצור ספרואידים סרטניים ואנקפסולציה הידרוג'ל11. לדוגמה, תאים מפוזרים יכולים להיות זרעים הידרוג'ל מותר ליצור spheroids לאורך זמן 5,12. חסרון אחד של שיטה כזו הוא polydispersity של spheroids שנוצרו, אשר יכול להוביל לתגובות תאים דיפרנציאליים. כדי לייצר ספרואידים אחידים, תאים יכולים להיות עטופים במיקרו-ג'לים ומתורבתים לפרקי זמן ממושכים עד שהם פולשים ומשפצים מחדש את הג'ל13, או שניתן להפקיד תאים בג'לים בתבנית עם 'חורים' כדוריים ולאפשר להם לצבור14. החיסרון של שיטות אלה הוא המורכבות היחסית שלהן, הצורך במחולל טיפות או אמצעים אחרים ליצירת מיקרוג'לים או "חורים" בג'ל, והזמן שלוקח לספרואידים לגדול ולהבשיל. לחלופין, ספרואידים יכולים להיווצר מראש במיקרו-בארות 9,15,16 או בלוחיות תלויות17,18 ואז לעטוף אותם בהידרוג'ל, בדומה לטכניקה שתוארה כאן. שיטות אלה פשוטות יותר וניתן לעשות זאת בצורה תפוקה גבוהה יותר. באופן מעניין, הוכח כי שיטת היווצרות הספרואידים יכולה להשפיע על התנהגויות תאים ספרואידים, כגון ביטוי גנים, התפשטות תאים, או היענות לתרופות19,20.

כאן, אנו מתמקדים בגליובלסטומה מכיוון שמדובר בגידול מוצק שסביבתו הטבעית היא מטריצת המוח הרכה והננו-נקבובית21, שניתן לחקות באמצעות הידרוג'ל רך וננו-נקבובי. גליובלסטומה הוא גם סרטן המוח הקטלני ביותר שאין לו תרופה זמינה22. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש לאנקפסולציה של ספרואידים המייצגים כל גידול מוצק. בחרנו להשתמש בהידרוג'לים מסוג PEG הנוצרים באמצעות תגובת חיבור מסוג מיכאל23. PEG הוא הידרוג'ל סינתטי, בלתי מתכלה ותואם ביולוגית, אינרטי המשמש כפיגומים וכתמיכה פיזית בתאים, אך אינו תומך בחיבור תאים23. ניתן להוסיף הדבקת תאים בנפרד באמצעות קשירה של חלבונים שלמים או ליגנדות דבק24, ופירוק ניתן להוסיף באמצעות שינויים כימיים של שרשרת פולימר PEG או קרוסלינקרים מתכלים הידרוליטית או אנזימטית25,26. זה מאפשר לכוונן תכונות ביוכימיות ללא תלות בתכונות הידרוג'ל מכניות או פיזיקליות, מה שיכול להיות יתרון בחקר אינטראקציות תא-מטריצה. כימיית הג'לציה מסוג מיכאל היא סלקטיבית ומתרחשת בתנאים פיזיולוגיים; לפיכך, הוא מאפשר אנקפסולציה ספרואידית פשוט על ידי ערבוב הספרואידים עם תמיסת קודמן הידרוג'ל.

בסך הכל, למתודולוגיה המוצגת כאן יש כמה מאפיינים בולטים. ראשית, ייצור ספרואידים סרטניים בהרכבה מרובת בארות הוא יעיל, מהיר, ועלות החומרים הנדרשים נמוכה. שנית, הספרואידים מיוצרים באצוות גדולות במגוון גדלים עם פיזור נמוך. לבסוף, נדרשים רק חומרים זמינים מסחרית. התועלת של המתודולוגיה מודגמת על ידי חקירת ההשפעה של תכונות המצע על כדאיות התא, המעגליות וגזע התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פתרונות

  1. הכנת תמיסת קודמן של פולידימתילסילוקסאן (PDMS)
    1. הכן את הפתרון המבשר PDMS שלילי (המשמש גם עבור תמיסת מבשר דבק). הכניסו את האלסטומר לסירת שקילה בעזרת מרית ושקלו אותו. הוסף את חומר הריפוי לבסיס האלסטומר ביחס של 1:10. ערבבו את ה-PDMS ואת חומר הריפוי בעדינות וביסודיות בעזרת המרית בסירת השקילה מפלסטיק.
      הערה: תמיסת מבשר PDMS זו נשפכת לתוך צלחת microwell פירמידלית מרובעת 6 באר כדי ליצור את התבנית השלילית. זהו אותו פתרון המשמש לפתרון מבשר דבק.
    2. הכן את הפתרון המבשר PDMS חיובי. הכניסו את בסיס האלסטומר לסירת השקילה בעזרת מרית ושקלו אותו. הוסף את חומר הריפוי לבסיס האלסטומר ביחס של 1:9. ערבבו את ה-PDMS ואת חומר הריפוי בעדינות וביסודיות בעזרת המרית בסירת השקילה מפלסטיק.
      הערה: תמיסת מבשר PDMS זו נשפכת מאוחר יותר על התבנית השלילית כדי ליצור את התבנית החיובית.
  2. הכנת חיץ של 0.3 M triethanolamine (TEA) של pH 8
    1. פיפטה 1 מ"ל של TEA ו 9 מ"ל של 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) לחרוט 50 מ"ל באמצעות פיפטה עזר ליצירת תמיסת TEA 0.75 M. טיטראט את התמיסה ל- pH של 8 באמצעות 1 N HCl או 1 N NaOH. לאחר מכן, הוסף מספיק PBS 1x כדי להשיג נפח סופי של 25 מ"ל כדי להשיג ריכוז TEA סופי של 0.3 M עם pH של 8.
      אזהרה: יש לאחסן תמיסות HCl ו-NaOH בארון דליק בטמפרטורת החדר (RT). יש ללבוש ציוד מגן אישי בעת הטיפול.
  3. הכנת מדיה מלאה
    1. להכנת המדיה המלאה, יש להוסיף 10% (w/v) או 56 מ"ל של נסיוב בקר עוברי ו-1% (w/v) או 5.6 מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין ל-500 מ"ל סל"ד בינוני.
    2. מניחים את התמיסה על 37°C למשך 10-20 דקות או עד שהתמיסה חמה לפני השימוש.
    3. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 0-4°C למשך עד 6 חודשים.
  4. הכנת 20% (w/v) פוליאתילן גליקול (PEG) תמיסות מלאי
    הערה: החישוב מבוסס על פתרונות של 100 μL שניתן להגדיל או להקטין לפי הצורך.
    1. להכנת תמיסת מלאי של 100 מיקרוליטר של 20% PEG-Acrylate עם 4 זרועות (PEG-Ac בעל 4 זרועות), יש לשקול 20 מ"ג אבקת PEG-Ac בעלת 4 זרועות בצינור מיקרופוגה. הוסף 70 μL של 0.3 M TEA buffer, ולאחר מכן מערבל את התמיסה במשך כ 30 s או עד מומס לחלוטין. יש לקחת בחשבון את שינוי הנפח עקב המסת אבקה על ידי הוספת מספיק חיץ TEA (~ 27 μL) כדי להגיע לנפח תמיסה סופית של 100 μL.
    2. להכנת תמיסת מלאי של 100 μL של 20% w/v PEG-diSH, יש לשקול 20 מ"ג אבקת PEG-diSH בצינור מיקרופוגה. מוסיפים 70 μL של חיץ TEA, ואז מערבלים את התמיסה במשך כ -30 שניות או עד להמסה מלאה. יש לקחת בחשבון את שינוי הנפח עקב המסת אבקה על ידי הוספת מספיק חיץ TEA (~ 27 μL) כדי להגיע לנפח תמיסה סופית של 100 μL.
      הערה: אבקת PEG היא היגרוסקופית מאוד ויש לאחסן אותה במיכל מיובש בטמפרטורה של -20°C. כשאתם מוציאים אותה מהמקפיא, תנו לאבקת ה-PEG להפשיר במשך 10 דקות לפני שאתם פותחים את הבקבוק כדי לשקול את האבקה. נקו את הבקבוק בגז אינרטי כגון חנקן או ארגון כדי להזיז את האוויר הלח לפני החזרתו למקפיא. ניתן לאחסן את תמיסת המלאי של PEG-Ac בעל 4 זרועות צלזיוס עד שבועיים לפני השימוש. יש להכין את תמיסת המניות של PEG-diSH מיד לפני השימוש ולא ניתן לאחסן אותה מכיוון שקבוצות התיול מגיבות זו עם זו ליצירת קשרים דיסולפידים.
  5. הכנת פתרון מטריצת קרום מרתף 2% v/v
    1. כדי להכין פתרון עבודה של מטריצת ממברנת מרתף 2% v/v, הוסף 20 μL של מטריצת קרום המרתף (ללא LDEV) ל- 9.98 מ"ל של מדיה שלמה וערבב היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה ~ 10 פעמים. מכינים את התמיסה ב 4 ° C (על קרח), ולאחר מכן לחמם אותו ל 37 ° C (בתנור או אינקובטור) ולהשתמש מיד.
      הערה: מטריצת קרום המרתף תתחיל ליצור ג'ל ב >10 ° C, לכן הקפד לערבב את תמיסת מטריצת קרום המרתף עם מדיה מלאה ב 2-6 ° C. הרכב המדיה המלא מתואר בשלב 1.3.
  6. הכנת פתרון קיבוע התא
    1. כדי להכין 1 מ"ל של תמיסה מקבעת תאים המכילה 4% w/v של paraformaldehyde ו 0.1% v/v של פעילי שטח nonionic, תחילה לערבב 891 μL של 1x PBS ו 108 μL של paraformaldehyde (ריכוז 37% w/v), ולאחר מכן להוסיף 1 μL של פעילי שטח nonionic (ריכוז 100%). ערבבו היטב את התמיסה ביסודיות.
      הערה: יש להפוך את הפתרון המקבע לרענן בכל פעם שמבוצע קיבוע.
      אזהרה: פרפורמאלדהיד דליק ועלול ליצור ריכוזי אבק דליק באוויר. זה גורם לגירוי בעור ונזק חמור לעיניים. הימנעו מנשימה מכיוון שזה עלול לגרום לגירוי נשימתי. יש לטפל בפרפורמאלדהיד במכסה מנוע של אדים כימיים וללבוש ציוד מגן אישי. יש לשטוף ידיים ביסודיות לאחר הטיפול. חומר פעילי השטח הלא יוני גורם לגירוי בעור ולנזק חמור לעיניים. יש ללבוש כפפות מגן והגנה על העיניים או הגנה על הפנים בעת הטיפול. כדי למנוע שחרור לסביבה, יש לפתוח את הבקבוק במכסה אדים כימי. יש לשטוף ידיים ביסודיות לאחר הטיפול.
  7. הכנת תמיסות הצביעה
    1. להכנת 3 מ"מ של יודיד 3,3'-dihexyloxacarbocyanine (DiOC), יש לערבב 2.65 מ"ג של DiOC ב-1 מ"ל של DMSO.
    2. כדי להכין 1.5 mM של תמיסת יודיד פרופידיום (PI), לערבב 1 מ"ג של PI ב 1 מ"ל של מים de-ionized.
  8. הכנת תמיסת הסליקה הספרואידית
    1. הכינו תמיסות סליקה של 20%, 40% ו-80% v/v של פורממיד ב-1x PBS לניקוי כדורי.
      1. כדי ליצור 10 מ"ל של 20% v/v פורממיד, ערבבו 8 מ"ל של 1x PBS ואחריו 2 מ"ל פורממיד. להכנת 10 מ"ל של 40% v/v פורממיד, ערבבו 6 מ"ל של 1x PBS ואחריו 4 מ"ל פורממיד. להכנת 10 מ"ל של 80% v/v פורממיד, יש לערבב 2 מ"ל של 1x PBS ואחריו 8 מ"ל פורממיד.
      2. לאחר שילוב של פורממיד ו-PBS אחד, מערבבים את התמיסה על ידי ערבול במשך כ-30 שניות.

2. ייצור מיקרו-בארות פירמידליות מרובעות

  1. לייצר תבנית PDMS שלילית של מיקרו-בארות פירמידליות מרובעות כפי שמוצג באיור 1.
    1. הכינו 2 גרם (~ 1 מ"ל) של תמיסת מבשר PDMS שלילית ושפכו אותה על באר אחת של תבנית מאסטר פירמידלית מרובעת 6 בארות. שים לב כי 1 מ"ל מכסה לחלוטין באר אחת של הצלחת. לאחר כיסוי תבנית האב עם PDMS, degas את הפתרון מבשר PDMS במשך 30 דקות על ידי הצבת צלחת פירמידלית מרובעת 6 בארות במייבש ואקום. לאחר מכן, לרפא את PDMS על ידי הנחת הצלחת לתוך תנור 60 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
      הערה: ודא שמכסה הצלחת הוסר לצורך פירוק גזים והוחזר לריפוי. דגה את התמיסה במייבש ואקום או באמצעות טיהור עם גז אינרטי כגון חנקן או ארגון. אם בתמיסת מבשר העובש השלילי עדיין יש בועות לאחר 30 דקות, המעידות על פירוק גזים לא מספק, הניחו אותו במייבש ואקום למשך 30 דקות נוספות. השתמש בבאר צלחת אחת או יותר בו זמנית כדי להכין תבנית שלילית PDMS אחת או יותר. ניתן להשתמש במיקרו-בארות פירמידליות מרובעות בגדלים שונים, כגון אורכי צד של 400 ו-800 מיקרומטר, כפי שמוצג בטבלה 1. אותה כמות של PDMS משמשת ללא קשר לגדלי הפירמידה המרובעים.
    2. לאחר שה-PDMS נרפא בעודו חם, הסר בזהירות את תבנית ה-PDMS השלילית מתבנית האב באמצעות מרית וחתך את התבנית השלילית בלוח בקוטר 35 מ"מ באמצעות ניקוב ביופסיה. מניחים בכלי פטרי ומכסים במכסה ומאפשרים את המשך ריפוי RT למשך 24 שעות נוספות.
      הערה: כדי להסיר תבניות שליליות, השתמש במרית כדי להגיע בין צלחת הבאר לתבנית PDMS ומשוך בעדינות את התבנית השלילית מתבנית האב. התבנית נחתכת ללוחות 35 מ"מ כדי להתאים לצלחת פטרי 35 מ"מ. ניתן לייצר תבניות בגדלים אחרים כדי להתאים לצלחות בקטרים שונים. ניתן לאחסן את לוחות העובש השלילי בקוטר 35 מ"מ, להגן עליהם מפני אבק ב-RT ולעשות בהם שימוש חוזר למשך 6 חודשים.
  2. הכינו תבנית PDMS חיובית של מיקרו-בארות פירמידליות מרובעות.
    1. הניחו את לוחות 35 המ"מ של תבנית PDMS השלילית לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ כאשר המיקרו-בארות בעלות המרקם פונות כלפי מעלה.
    2. הכינו 2.5 גרם (~ 1.2 מ"ל) של תמיסת מבשר PDMS חיובית כנ"ל ושפכו אותה על התבנית השלילית בצלחת פטרי 35 מ"מ כדי לכסות לחלוטין את העובש השלילי. לאחר מכן מפחיתים את תמיסת הקודמן למשך 30 דקות כנ"ל ומכניסים אותה לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שעות.
      הערה: מאחר ש-PDMS צמיג, בועה יכולה להיווצר מאוויר הכלוא מתחת לתבנית השלילית. אם נוצרת בועה מתחת לתבנית השלילית, דחפו את התבנית מטה בעדינות בעזרת מרית כדי לשחרר את הבועה. אם נשארות בועות אוויר, המשיכו להוריד גזים במשך 30 דקות, או קחו מרית וערבבו בעדינות את תמיסת העובש החיובית עד שהבועות יתפוצצו.
    3. לאחר שתבנית PDMS החיובית נרפאת, הסירו את התבניות מצלחת פטרי 35 מ"מ ומיד קלפו את העובש החיובי מהתבנית השלילית.
      הערה: העיתוי חשוב לקילוף מוצלח של העובש החיובי. ההסרה נעשית בצורה הטובה ביותר על ידי חיתוך קל לתוך התבנית החיובית באמצעות סכין גילוח כדי לחשוף את הממשק בין העובש החיובי לשלילי ולקלף את התבניות זו מזו. לאחר מכן מקלפים את שולי התבנית המעגלית. מקלפים בעדינות את העובש השלילי מהתבנית החיובית.
  3. מדביקים את התבניות לתחתית הבארות של צלחת 48 בארות.
    הערה: כאן, צלחת 48 באר משמש, אבל לוחות אחרים ניתן להשתמש כל עוד לוחות תבנית נחתכים לקטרים הנכונים (למשל, 6 מ"מ קוטר עבור צלחת 96 באר).
    1. חותכים את התבניות החיוביות ללוחות באמצעות ניקוב ביופסיה 10 מ"מ.
      הערה: ניתן לחתוך כ-4 תבניות (כל אחת בקוטר 10 מ"מ) מתבנית חיובית אחת בקוטר 35 מ"מ.
    2. כדי להדביק את התבניות לתחתית צלחת 48 בארות, הכינו את תמיסת מבשר דבק PDMS (~ 0.5 מ"ל או 1 גרם) כמתואר לעיל27. השתמש בפינצטה כדי לטבול בעדינות את הצד השטוח (לא את הצד עם תבנית המיקרו-בארות) של התבנית החיובית בקוטר 10 מ"מ בתמיסת קודמן PDMS. מניחים בזהירות תבנית אחת לכל באר של צלחת של 48 בארות, ולוחצים בעדינות על כל תבנית לתחתית הבאר באמצעות הטוויטר. מניחים את הצלחת שהורכבה בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 4-24 שעות כדי לאפשר לדבק PDMS להחלים.
      הערה: אם תמיסת מבשר דבק PDMS עולה על מיקרו-בארות העובש החיוביות, ניתן לנגב אותה באמצעות נייר טישו רך, וניתן לחזור על הצעד. בעת ההדבקה, ודא כי הדבק אינו מכסה את microwells.
    3. לעקר תבניות על ידי הוספת 300 μL של 70% אתנול לתוך כל באר של צלחת 48 באר באמצעות פיפטה 1000 μL. שאפו לאתנול 70% והניחו את הצלחת בת 48 הבארות חשופה במכסה מנוע של תרבית רקמה תחת UV (302 ננומטר) למשך שעתיים.
      הערה: ניתן להשתמש בתבניות במשך 6 חודשים ולעקר אותן מחדש לפי הצורך.

3. היווצרות ספרואיד גידול רב-תאי, קציר ואנקפסולציה בהידרוג'לים

הערה: הפרוטוקול המתואר בסעיף זה הוא עבור קו תאי גליובלסטומה אנושיים U87 (ראו איור 1 ואיור 2), אולם פרוטוקול דומה יכול לשמש עם סוגי תאים סרטניים אחרים.

  1. היווצרות ספרואיד גידול רב-תאי
    1. שטפו תחילה תבניות מיקרווול בתמיסת שטיפה נוגדת היצמדות על ידי הוספת 300 מיקרוליטר של התמיסה לכל באר באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1620 x גרם במשך 3 דקות ולשאוף את הפתרון באמצעות משאבת ואקום פיפטה פסטר.
      הערה: בצע שלב זה מיד לפני זריעת תאים.
    2. חשוף את התאים ~ 80 μL של 0.25% טריפסין/EDTA לכל ס"מ2 של אזור בקבוק התרבית במשך 5 דקות ב 37 ° C. לדוגמה, 1 מ"ל של טריפסין/EDTA מתאים לצלוחית תרבית תאים T-25. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת נפח זהה של מדיום תרבית תאים מלאה. לדוגמה, הוסף 1 מ"ל של מדיום שלם לצלוחית תרבית תאי T-25 המכילה טריפסין. לאסוף את התאים מן בקבוק תרבית הרקמה.
    3. העבר 10 μL של תרחיף התא לכל יציאה של המוציטומטר לספירת תאים. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לספור את המספר הכולל של תאים וממוצע של ספירת תאים זו מלפחות 8 רבעים, כדי להבטיח שמספר התא בכל רביע המוציטומטר הוא 20-50 לקבלת תוצאות טובות של ספירת תאים. הכפל את המספר המחושב ב- 104 כדי לקבוע את ריכוז התא הסופי.
    4. יש להשהות מחדש את התאים שנאספו במדיום תרבית תאי RPMI המלא בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין בריכוז התאים הסופי הרצוי, בהתאם לגודל הספרואיד הרצוי, כפי שמוצג בטבלה 1.
      הערה: המיקרו-בארות של 800 מיקרומטר יניבו ~75 ספרואידים בבאר אחת של צלחת של 48 בארות, והמיקרו-בארות של 400 מיקרומטר יניבו ~300 ספרואידים בבאר אחת של צלחת של 48 בארות.
    5. מניחים 500 μL של תרחיף התא בריכוז הרצוי microwells וצנטריפוגה את הצלחת ב 1620 x גרם במשך 3 דקות. הניחו את הצלחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 24 שעות כדי לאפשר להיווצרות ספרואידים.
      הערה: אם ספרואידים אינם נוצרים, ניתן להשתמש ב- 2% v/v של מטריצת קרום המרתף בשילוב עם מדיה שלמה כדי להשהות תאים מחדש (פרטים נוספים בשלב 1.5).
  2. קצירת ספרואידים
    1. באמצעות פיפטה 1000 μL, פיפטה היטב 500 μL של תווך שלם לתוך הבאר. באמצעות 500 מיקרוליטר של תווך מהבאר, שטפו את ארבעת הרבעים של הבאר (במיוחד הרביע העליון, התחתון, השמאלי והימני) על ידי פיטום למעלה ולמטה ברבעים שלוש עד ארבע פעמים כדי לעקור את הספרואידים. שאפו בעדינות את התווך המכיל את הספרואידים (~ 1000 μL בסך הכל) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטה של 1000 μL ואפשרו לכדורידים לשקוע לתחתית.
    2. מוציאים את הסופרנאטנט ומרחפים מחדש את הספרואידים לריכוז הסופי הרצוי. לדוגמה, כדי להשיג ~8 ספרואידים בג'ל של 20 μL לאחר אנקפסולציה, יש להשהות מחדש את הספרואידים ב-100 μL של מדיה, מה שמניב ריכוז ספרואידי של ~75 ספרואידים / 100 μL בתרחיף הספרואידים.
  3. אנקפסולציה של ספרואידים בהידרוג'לים, כפי שמוצג באיור 2.
    1. כדי ליצור 100 μL של תמיסת קודמן הידרוג'ל 10% w/v PEG, שלב 50 μL של מתלה הספרואידים, לאחר מכן 30 μL של 20% w/v 4-arm PEG-Ac ולבסוף 20 μL של 20% w/v PEG-diSH בצינור מיקרוצנטריפוגה. זה ייתן יחס מולארי סטוכומטרי של קבוצות אקרילט (Ac) לתיול (SH) ויבטיח קרוסלינקינג אופטימלי. מערבבים את תמיסת מבשר הג'ל על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ~ 10 פעמים.
      הערה: ניתן לשנות את הרכב ההידרוג'ל, הנפח והקונצרטציה הפולימרית לפי הצורך. ההידרוג'לים המתקבלים יהיו מתפרקים לאט ולא נדבקים תאים. כדי להפוך את תא הידרוג'ל דבק, ליגנד דבק כגון RGDS ניתן להוסיף. כדי להפוך את ההידרוג'ל למתכלה אנזימטית, ניתן להוסיף קרוסלינקר פפטידי מתכלה אנזימטית המכיל שאריות ציסטאין בשני קצותיו. בעת העברת ספרואידים, יש לשטוף בעדינות את התמיסה פעמיים כדי לעקור ספרואידים ולהביא אותם לתרחיף כדי להבטיח פיזור אחיד של הספרואידים.
    2. פיפטה 20 μL של תמיסת קודמן הג'ל בין שתי שקופיות זכוכית מרופדות פרפילם המופרדות עם ספייסרים סיליקון 1 מ"מ, ומניחים שקופיות עם תמיסת קודמן ג'ל ב 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור במשך 15 דקות כדי לאפשר gelation.
      הערה: ודא ששתי שקופיות הזכוכית מכוסות בפרפילם כדי ליצור משטח הידרופובי המאפשר קילוף קל בעת הג'לציה. במקום פרפילם, ניתן להשתמש בתמיסת ציפוי הידרופובית. נפח של 20 μL של תמיסת קודמן הידרוג'ל יגרום ללוח הידרוג'ל בקוטר ~6 מ"מ וגובה 1 מ"מ לפני הנפיחות. ניתן להשתמש בכל סוג ועובי ספייסר, אך מומלץ שעובי הג'ל יישמר על 1 מ"מ או פחות (הידרוג'לים עבים יותר עלולים להגביל את פיזור החמצן ואת הובלת החומרים המזינים לתאים) אך גדול יותר מקוטר הספרואיד (כך שהספרואידים עטופים לחלוטין בג'ל). ניתן להשתמש בכל נפח של תמיסת מבשר הידרוג'ל. הג'לים 20-30 μL מתאימים לצלחת 24 בארות.
    3. לאחר השלמת ג'לציית ההידרוג'ל, הפרידו בין שתי מגלשות הזכוכית וקילפו בעדינות את הג'לים מצלחת הזכוכית בעזרת מרית. הכניסו את הג'לים לצלחת של 24 בארות, אחת לכל באר, וודאו שהמשטח המכיל את הספרואידים פונה כלפי מעלה.
      הערה: ספרואידים ייפלו לתחתית הג'ל במהלך הג'לציה, כך שהיפוכם לצורך תרבית יבטיח שהספרואידים יהיו קרובים לפני השטח של ההידרוג'ל לגישה טובה יותר לחומרים מזינים ולחמצן. ניתן לנטר את הג'לציה על ידי התבוננות בכל תמיסת קודמן הידרוג'ל שנותרה בצינור המיקרוצנטריפוגה ולא להשתמש בה ליצירת לוחות על ידי היפוך הצינור וציון הזמן שבו הג'ל מפסיק לזרום.
    4. הוסף מדיום שלם (~ 500 μL) לכל באר וודא שההידרוג'ל שקוע לחלוטין. מניחים את צלחת multiwell באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2 ו תרבית את התאים עם שינויים בינוניים כל 2-3 ימים.
      הערה: הידרוג'לים ניתן לתרבית עד 4 שבועות או עד שההידרוג'לים מתפרקים, ומחליפים את המדיה כל יומיים.

4. צביעה פלואורסצנטית

  1. כדאיות התא
    1. השתמש בכתם 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC), אשר מכתים את המיטוכונדריה ואת הרשתית האנדופלסמית של כל התאים, כדי לקבוע את כדאיות התא. יש להשתמש ב-DiOC (3 מ"מ) בריכוז של 0.02 מיקרוגרם/מ"ל. באופן ספציפי, השתמש פיפטה 20 μL כדי להוסיף 2 μL של DiOC לכל 1000 μL של מדיה לתוך בקבוק תרבית התאים מנותקים (לפחות 24 שעות לפני תהליך היווצרות של spheroids בסעיף 3). המתינו 24 שעות עד שה-DiOC יכתים את התאים.
    2. השתמש בכתם הגרעין והכרומוזום, פרופידיום יודי, PI (1.50 מילימול), אשר נכנס רק תאים מתים. כדי להכתים את התאים, תחילה שאפו את כל המדיה ושטפו את הג'ל באמצעות פיפטה של 1000 μL כדי להוסיף 500 μL של 1x PBS כך שהג'ל יהיה שקוע לחלוטין.
    3. שאפו את PBS והוסיפו 500 μL של מדיה טרייה, ואחריה 30 μL של תמיסת PI לכל באר (כלומר, 6 μL לכל 100 μL של מדיה). כסו את צלחת הבאר ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור. הניחו את צלחת הבאר באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 והמתינו 30 דקות עד שה-PI יכתים את התאים המתים.
    4. מוציאים את נייר הכסף ושואבים את התקשורת מהבארות. השתמש פיפטה 1000 μL כדי להוסיף 500 μL של 1x PBS כדי לטבול את הידרוג'ל. יש לשאוף את ה-PBS 1x ולחזור על השטיפה פעמיים נוספות. הוסף 500 μL של מדיה לכל באר ותמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך או קונפוקלי.
    5. חשב את כדאיות התא על ידי השוואת השטח של DiOC (כל התאים) ל- PI (תאים מתים), כפי שמיוצג במשוואה 1, באמצעות תמונות מחסנית z ממיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
      Equation 1 ש. 1.

5. קיבוע אימונופלואורסצנטי, צביעה, ניקוי והדמיה של ספרואידים עטופים

  1. קיבוע והכתמה
    1. שאפו את המדיה מהבארות שבהן מתרבתים ההידרוג'לים, ושטפו את ההידרוג'לים על ידי פיפטינג של 500 מיקרוליטר של 1x PBS ישירות על ההידרוג'לים. שאפו בעדינות את 1x PBS.
    2. תקן את הספרואידים בצלחת 24 באר באמצעות פיפטה 1000 μL כדי להוסיף נפח 500 μL של תמיסה קיבוע לכל באר. תנו לחומר הקיבוע להשרות את הג'לים למשך 30 דקות ב-RT. הוציאו את התמיסה המקבעת באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר והשליכו למיכל פסולת ייעודי.
    3. שטפו את ההידרוג'לים על ידי הוספת 500 μL של 1x PBS לכל באר. יש לשאוף את ה-PBS 1x באמצעות פיפטה של 1000 μL ולחזור על שטיפת PBS פעמיים נוספות. אחסנו את צלחת הבאר ב-500 מיקרוליטר של 1x PBS לבאר בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע או השתמשו מיד.
      הערה: היזהר לא למשוך את ההידרוג'לים לתוך פיפטה בעת שאיפת PBS ותמיסה מקבעת. עשו זאת על ידי הטיית הצלחת לזווית ~ 45 מעלות, אשר תסייע לראות את ההידרוג'לים ולמנוע שאיפה מקרית.
      אזהרה: פורמלדהיד רעיל בשאיפה ובמגע. יש לטפל עם כפפות במכסה מנוע של אדים כימיים.
    4. כדי להכתים את התאים, יש לדגור על הספרואידים בעטוף הידרוג'ל עם נוגדנים ראשוניים לנסטין (200 מיקרוגרם/מ"ל) ו-SOX2 (200 מיקרוגרם/מ"ל) בדילול של 1:200 נוגדן: PBS. השתמש פיפטה 1000 μL כדי לשאוף את PBS 1x מן הבארות. מוסיפים 50 μL של נוגדן מדולל לכל באר. יש להמתין 24 שעות להשלמת הצביעה. לאחר מכן, הסירו את תמיסת הצביעה באמצעות פיפטה של 1000 μL והשליכו את הפסולת בהתאם.
    5. השתמש פיפטה 1000 μL להוסיף 500 μL של 1xPBS, וזה מספיק כדי לטבול את הידרוג'ל. שאפו על PBS וחזרו עליו עוד פעמיים. אחסנו את ההידרוג'ל המוכתם והשקוע ב-1x PBS בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים לפני ההדמיה או התמונה באופן מיידי.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציות קלות בהתאם לנוגדן כדי להבטיח כתמים נאותים. הריכוז (1:200) והזמן (24 שעות) גבוהים משמעותית מאשר בתרבית תאים חד-שכבתית דו-ממדית טיפוסית מכיוון שצביעה תלת-ממדית דורשת דיפוזיה דרך ההידרוג'ל והספרואידים.
  2. לאחר צביעת הספרואידים, נקו את הספרואיד כדי לשפר את השקיפות להדמיה על ידי החלפת PBS בעלייה רציפה בריכוז פורממיד (אופציונלי).
    1. שאפו את ה-PBS 1x מכל באר. הוסיפו 500 מיקרוליטר של 20% פורממיד לכל באר ותנו להידרוג'ל לדגור במשך 90 דקות. שואפים את הפורממיד באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר ואוספים את הפסולת במיכל פסולת.
    2. מוסיפים 500 μL של 40% (v/v) formamide לבאר. תנו להידרוג'ל לדגור בתמיסה למשך 90 דקות. שאפו את הפורממיד ואספו את הפסולת במיכל הפסולת.
    3. מוסיפים 500 μL של 80% v/v formamide לכל באר ודגרים במשך 90 דקות. שואפים את הפורממיד ומשליכים למיכל הפסולת. הוסף 500 μL של 100% (v/v) של פורממיד ואפשר דגירה של 24 שעות לפני ההדמיה. בסיום הפינוי, יש להשליך כראוי את פסולת הפורממיד באמצעות השירותים המתאימים של מערכת ניהול פסולת מעבדה.
      הערה: ניקוי מאפשר הדמיה קונפוקלית לתוך ליבת הספרואיד והוא אופציונלי אם רק הפריפריה של הספרואיד נחקרת.
  3. הדמיה של ספרואידים עטופים בהידרוג'ל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: כל מיקרוסקופ - הפוך, פלואורסצנטי או קונפוקלי - יכול לשמש להדמיית תאים; עם זאת, קונפוקל מאפשר בידוד של מטוסים בודדים.
    1. הניחו את ההידרוג'לים בבארות עם תחתיות כיסויי זכוכית ומקמו את הספרואידים קרוב ככל האפשר לכיסוי.
      הערה: ניתן להשתמש בכיסויי זכוכית או בארות עם תחתיות כיסויי זכוכית. חשוב לשמור על הידרוג'ל רווי מים, שכן דגימות מיובשות יגרמו לאיכות הדמיה ירודה.
    2. דמיינו את הדגימות עם יעד למרחק עבודה ארוך (10x-20x) כדי לאפשר הדמיה עמוק לתוך הספרואיד באמצעות ערימות Z לשחזורים תלת-ממדיים.
      הערה: מטרות הגדלה גבוהות יותר מאפשרות הדמיה מפורטת יותר וחתך אופטי, אך מקריבות את עומק התמונה.
    3. כמת את כמות האות הקיימת בחלק האופטי ביחס לשטח הכולל של הספרואיד הן עבור האות המנוקה והן עבור האות שלא נוקה באמצעות משוואה 2.
      Equation 2 פרק 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פלטפורמות סינון תרופות מבוססות ספרואידים לחקר השפעות כימותרפיות מבוקשות יותר ויותר בשל הדגש על אפנון המיקרו-סביבה של הגידול על אנקפסולציה ספרואידית בביו-חומרים המשכפלים רקמות טבעיות. כאן פיתחנו שיטה להכנת ספרואיד גידול רב-תאי ולאחר מכן אנקפסולציה והדמיה בהידרוג'ל תלת ממדי. הספרואידים מוכנים בתבניות מיקרו-באר (איור 3A,B), אשר גורמות לכדורידים בעלי צורות כדוריות ופיזור רב-פעמי מבוקר היטב. לדוגמה, עבור ספרואידים עם 3,300 תאים למיקרו-באר, גודל הספרואיד הממוצע היה ~250 מיקרומטר, והמעגליות הייתה 0.8 >, כאשר 1 הוא כדור מושלם (איור 3C,D). אחוז מקדם השונות (%CV) לקוטר ספרואידי היה 19.3%, ו%CV לקוטר מעגלי היה 4.5%. הקטרים הכדוריים היו תלויים במספר התאים למיקרו-באר, כפי שמוצג בטבלה 1. שימו לב שייתכן שחלק מהתאים במיקרו-בארות לא ישולבו בספרואיד ויישטפו במהלך שלב קצירת הספרואידים.

הספרואיד מסוגל להיות מצולם בעומקים משתנים של מחסנית Z, מה שמאפשר קיום תאים עבור כל מיקום בתוך מחסנית Z (איור 4). שים לב שבשל מגבלות הדמיה קונפוקלית וצפיפות התאים הגבוהה, לא ניתן היה לצלם את ליבת הספרואיד במלואה. כפי שנדון בהמשך, ייתכן שיהיה צורך בניקוי או חתך ספרואידים לצורך הדמיה משופרת לאורך הספרואידים. בשיטה זו, הכדאיות הספרואידית נקבעה כגבוהה (~90%) מיד לאחר הקציר והאנקפסולציה, למרות שכדאיות התא ירדה מעט ל-85% בליבת הספרואיד בהשוואה לפריפריה. כדי להבטיח כדאיות לאורך הספרואידים, ספרואידים נותקו באמצעות אקוטאוז, והכדאיות של התאים המנותקים חושבה באותה שיטה ונמצאה גבוהה באותה מידה (>90%). הקרנה מקסימלית המשתמשת בערימת הספרואידים מייצגת את הנקודה הגבוהה ביותר של עוצמת האור בכל מיקום של ערימת Z הדחוסה לתמונה אחת (איור 4B).

תמונות מייצגות של ספרואידים צפים בחופשיות (ללא ג'ל) וספרואידים עטופים (ג'ל PEG) מוכתמים עבור סמני גזע Nestin ו-SOX2 מוצגות באיור 5. נסטין הוא חוט להט ביניים וסמן תאי גזע הקיים בגליומות. SOX2 הוא גורם שעתוק להתחדשות עצמית, הקיים גם בגליומות. SOX2 נמצא במיקום משותף עם DAPI בגרעין, בעוד נסטין היה נוכח בכל התאים. הנתונים לא מראים הבדל בין תנאי הג'ל ללא ג'ל, אולי בגלל שג'ל ה-PEG המשמש כאן הוא אינרטי ולא מאפשר אינטראקציות בין מטריצת תאים באמצעות איתות אינטגרין.

מגבלה עיקרית של הדמיה היא צפיפות הספרואידים הגבוהה, מה שמקשה על התמונה לתוך הליבה הספרואידית. שיטות נפוצות לדימוי ליבת הספרואיד כוללות חתך וניקוי המקטעים. זה יכול לעבוד היטב עם ספרואידים צפים חופשי, אבל חיתוך הידרוג'לים הוא קשה, ורוב ניקוי רקמות כרוך דגימות התייבשות, אשר גורם דגימות מעוותות. כאן התאמנו פרוטוקול של Kuwajima et al.28 עבור דגימות הידרוג'ל כדי לשמור על המבנה הספרואידי תוך כדי ניקוי הספרואידים. כדי להדגים את התועלת של שיטת הניקוי תוקנו, תוקנו, הוכתמו ב-PI ונוקו (איור 6). איור 6A מראה תמונות מייצגות של מקטעים אופטיים ב~90 מיקרומטר לתוך ספרואידים מנוקים ולא מנוקים, ואת השטח הכולל של הספרואיד כאשר האזור הספרואידי מלא. כאשר הניקוי בוצע, ניתן היה לצלם את ליבת הספרואיד ~30 מיקרומטר עמוק יותר, בהשוואה לכדורית שלא נוקתה (איור 6B). ניקוי יכול להיות מועיל מאוד עבור immunofluorescence, כמו הארגון המרחבי של סמנים ביולוגיים ניתן לנתח לתוך הליבה של spheroids. שיטה זו יכולה לשמש רק עבור דגימות קבועות כמו שלמות הממברנה משובשת.

Figure 1
איור 1: ייצור עובש PDMS והיווצרות ספרואידים. פתרונות מקדימים PDMS מתווספים ללוחות מיקרווול פירמידליים מרובעים ליצירת תבניות PDMS. תרחיף התאים המנותק מתווסף לתבניות PMDS שנוצרו ומסובב כלפי מטה כדי לאפשר היווצרות ספרואידים לאחר 24 שעות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אנקפסולציה של הידרוג'ל, תרבית והדמיה. (A) PEG-Ac, PEG diSH בעל 4 זרועות ותרחיף הספרואיד משולבים בצינור מיקרוצנטריפוגה ו-(B) מעורבבים היטב על-ידי פיפטציה למעלה ולמטה ליצירת תמיסת קודמן ג'ל. (C) 20 μL של תמיסת קודמן הג'ל מודבקים על מגלשת זכוכית, ומגלשת זכוכית שנייה מונחת על גבי התמיסה ומופרדת על ידי ספייסרים בקוטר 1 מ"מ. (D) הידרוג'ל מועבר ל-24 צלחות באר עם ספרואידים הפונים כלפי מעלה ומכוסה במדיה (500 μL). (E) הידרוג'ל מועבר לכיסוי זכוכית לצורך הדמיה במיקרוסקופיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: היווצרות ספרואידים במיקרו-בארות לפני הקציר, 24 שעות לאחר זריעת התאים הראשונית במיקרו-בארות. (A) ספרואידים במיקרו-באר מוכתמים ב-DiOC (ירוק). סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר. (B) תמונת שדה בהיר של ספרואידים במיקרו-בארות. (C) היסטוגרמה של קוטר ספרואיד במיקרו-בארות. (D) היסטוגרמה של מעגליות ספרואידית במיקרו-בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תמונה קונפוקלית מייצגת של מחסנית Z של ספרואיד חי לניתוח מת חי. (A) תמונות מ-4 פרוסות של ערימת Z עם DiOC (ירוק) ו-PI (אדום). סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר. (B) היטל מרבי של Z-Stack. (C) כדאיות התא כפונקציה של עומק הספרואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: Nestin ו-SOX2 immunostaining של תאי U87 צפים בחופשיות (ללא ג'ל) ובקפסולות הידרוג'ל (PEG gel) ביום 5 לתרבית. תמונות קונפוקליות מייצגות של הספרואידים מאשרות את הביטוי Nestin (אדום) ו-SOX2 (ירוק), אשר הוכתמו ב-DAPI (כחול; גרעין). סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. תמונות שנחתכו והוגדלו מהריבוע הלבן מציגות את הקשר בין הגרעין (כחול) ל-SOX2 (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: עומק הדמיה של ספרואידים מנוקים. (A) תמונות מייצגות של ספרואידים שצולמו ב-91.6 מיקרומטר לתוך שטח הספרואיד והשטח הכולל של הספרואידים. (B) אחוז השטח הכדורי המצולם כעומק לתוך הספרואיד גדל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גודל מיקרווול (μm) מספר התאים לכל ספרואיד מספר תאים לבאר ריכוז תאים (תאים/מ"ל) קוטר ספרואידי (μm)
400 200 120000 240000 115.4 ± 13.5
500 300000 600000 144.6 ± 14.3
1000 600000 1200000 176.5 ± 12.5
800 2000 300000 600000 212.1 ± 15.7
3000 450000 900000 258.9 ± 16.3
4000 600000 1200000 305.7 ± 21.6
5000 750000 1500000 323.4 ± 29.8

טבלה 1: קוטר ספרואיד וגודל מיקרובאר. מספר התאים המחושב לכל ספרואיד, מספר התאים לבאר של צלחת 48 בארות, ריכוז התא וקוטר הספרואיד המתקבל בהתאם לגודל המיקרו-באר של תבנית PDMS שלילית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודלים ספרואידים רב-תאיים מבוססי הידרוג'ל מפותחים יותר ויותר כדי לקדם תגליות טיפוליות בסרטן 11,13,29. הם מועילים מכיוון שהם מחקים פרמטרים מרכזיים של מיקרו-סביבת הגידול באופן מבוקר, ולמרות מורכבותם, הם פשוטים וזולים יותר לשימוש מאשר מודלים in vivo, ורבים מהם תואמים לטכנולוגיות סינון בתפוקה גבוהה. ניתן לכוונן את הביו-חומרים של ההידרוג'ל כך שיחקו את המטריצה החוץ-תאית של הגידול ויאפשרו אינטראקציות תא-מטריצה, והספרואיד (בניגוד לתאים מנותקים) מחקה את האינטראקציות בין תאים לתאים של הגידול הטבעי. הידרוג'לים סינתטיים, כפי שהודגם כאן, הם בעלי יתרון מיוחד מכיוון שההידרוג'ל מספק את התמיכה המבנית הרצויה ואת התכונות הפיזיות והמכאניות, בעוד שניתן להשתמש בליגנדות דביקות או רצפים מתכלים לכוונון עצמאי של תכונות החומר הביוכימי. הידרוג'לים סינתטיים מציעים גם שונות נמוכה יותר בין אצווה לאצווה וטווחים גדולים יותר של תכונות חומר, המקיפים את רוב הרקמות הרכות בגוף.

כאן, אנו מתארים בפירוט את השימוש בהידרוג'ל אינרטי מבוסס PEG שנוצר באמצעות תוספת מסוג מיכאל כפי שתואר קודם 25,30. הידרוג'ל PEG המייצג המשמש כאן יש מודולוס של יאנג של ~ 8 kPa, בדומה לקשיחות רקמת גליובלסטומה9. הידרוג'ל PEG נוח מאחר שיש לו תכונות כוונון וכימיית ג'לציה ספציפית מאוד, והוא יכול להיווצר בנוכחות ספרואידים מבלי לפגוע בכדאיות התא (איור 4). בעוד הידרוג'ל PEG הוא אינרטי ומשמש כפיגומים תאיים בעלי תכונות פיזיקליות ומכניות מוגדרות, ניתן להוסיף ליגנדות דבק תאים כדי להנחות אינטראקציות בין תאים למטריצה, וניתן להוסיף קרוסלינקרים פפטידים מתכלים אנזימטית כדי לסייע בעיצוב מחדש של מטריצה9. ליגנדות דביקות וקרוסלינקרים פפטידים יכולים להיבחר כדי לחקות את המיקרו-סביבה התאית כדי להוסיף רלוונטיות פיזיולוגית או פתולוגית למודל. לפרטים נוספים על שינויים בהידרוג'ל PEG לכוונון פירוק הידרוג'ל, תכונות מכניות והדבקה, הקוראים מופנים לעבודה הבאה שפורסמה 9,27.

באמצעות השיטה המתוארת כאן, כמויות גדולות של ספרואידים סרטניים יכולות להיווצר במהירות ולעטוף אותן בהידרוג'ל PEG כדי לחקור את ההשפעה של תכונות המצע על כדאיות התא, המורפולוגיה או גזע התא (איור 4 ואיור 5), בין תכונות אחרות. תחילה מאפשרים לתאים להצטבר וליצור ספרואיד ואז עטופים בהידרוג'לים, כפי שמוצג באיור 2 ובאיור 3. תהליך הצבירה מאפשר לשנות את גדלי הספרואידים בהתבסס על גודל תבניות המיקרו-באר וריכוז תרחיף התאים המוזרם לתוך תבניות המיקרו-באר (טבלה 1). הספרואידים המתקבלים הם חד-פיזוריים יחסית בגודלם, עם מקדם שונות ממוצע של ~10%-20% לכל התנאים. זה מועיל עבור מגוון רחב של יישומים, כמו גדלים דומים יציגו מגבלות דיפוזיה דומות, בין אם זה של תרופות, חומרים מזינים, או חמצן, לתוך spheroid. לכדורואידים יש גם מעגליות של 0.8 >, הדומה לשיטות אחרות של חיבור נמוך במיוחד או טיפה תלויה31. שימו לב שניתן להשתמש תחילה בשיטות אחרות ליצירת ספרואידים, כגון שיטת הטיפה התלויה או מערכת תרבית תאים סיבובית32, ולאחר מכן לעטוף בהידרוג'ל. עם זאת, השיטה המתוארת כאן אינה דורשת ציוד מיוחד או חומרים מתכלים יקרים, ומכאן סיוע בנגישות לכל המעבדות.

בעוד שהשיטות המוצגות כאן משתמשות בקו תאי גליובלסטומה U87-MG, ניתן להשתמש בשיטת ייצור הספרואידים והאנקפסולציה המתוארת עבור סוגי תאים סרטניים שונים היוצרים גידולים מוצקים. אם התאים אינם מצטברים בקלות ליצירת ספרואיד, ניתן להוסיף לתרחיף התא תערובת של חלבוני ECM, כגון מטריצת קרום מרתף, כדי לסייע בתהליך (כמתואר בשיטות). לאחר שהספרואידים עטופים, עדיף להיות מצולמים ומנותחים ישירות בהידרוג'ל במקום להיות מופקים מההידרוג'ל או מהתאים המנותקים. הסיבה לכך היא שספרואידים הם בדרך כלל הטרוגניים (למשל, ליבה היפוקסית יכולה להיווצר עקב חמצן ושיפועים תזונתיים), ותגובות התאים יהיו שונות בהתאם למיקום בתוך הספרואידים. כמו כן, מיצוי תאים עשוי לטשטש את התפקיד של אינטראקציות תא-מטריצה על גורל הספרואידים. לדוגמה, הראינו בעבר שלתאים בפריפריה הספרואידית לעומת הליבה יש היענות שונה לכימותרפיה, מה שתלוי עוד יותר בתכונות המכניות של המצע27. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש בטכניקות מיקרוסקופיה לחקר התנהגויות ספרואידיות, כפי שמודגש בכתב יד זה.

נושא אחד שיש לקחת בחשבון בעת הדמיה של רקמות צפופות כגון ספרואידים הוא האטימות שלהן. כאן אנו מתארים שיטת ניקוי לשיפור יכולת ההדמיה דרך פנים הספרואיד (איור 6). עם זאת, למרות שניקוי הספרואידים מסייע למקסם את עומק ההדמיה, ניתן למצוא מגבלות בעת הנחת הספרואידים העטופים בפורממיד וכתוצאה מכך נזק מבני פוטנציאלי והשפעה על יכולת הצילום של הספרואידים. תהליך זה גם לא יכול להתבצע בעת התבוננות בכדאיות התא באמצעות צביעה חיה/מתה, מכיוון שהניקוי דורש קיבוע. תהליך הניקוי דורש גם מספר שעות של דגירה בפורמיד לאחר הצביעה, כך שהוא עלול להשפיע על הצבעים בהם משתמשים. טכניקות אחרות, כגון cryosectioning ולאחר מכן immunostaining, יכול גם לעבוד, בתנאי שהחתך אינו מעוות או פוגע בשלמות הרקמה הספרואידית. בידינו, קריוסקציה גרמה לספרואידים "מעוכים" בגלל רכות ההידרוג'ל, שהיא ~ 8 kPa במודולוס של יאנג, כדי לחקות נוקשות רקמת גליובלסטומה.

בסך הכל, השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם ייצור ספרואידי מוצלח, אנקפסולציה ותרבית הידרוג'ל, והדמיה וניתוח ספרואידים; לפיכך, סיפקנו הערות ואסטרטגיות לפתרון בעיות עבור שלבים אלה. הספרואידים עטופים בהידרוג'ל המתוארים כאן יכולים לשמש במגוון יישומים, כגון פלטפורמות סינון תרופות, מחקרים מפורטים על אינטראקציות בין תאים למטריצה והשפעתן על התנהגויות תאים, מחקרים על אטיולוגיה של מחלות וכו '. מחקרים כאלה יכולים להיעזר בכוונון המערכת המתוארת כפי שנדון לעיל ובתכונות הצפויות והניתנות לשליטה של הידרוג'ל PEG סינתטי. חלק מהמגבלות של המערכת המתוארת כוללות תפוקה בינונית, כאשר תפוקה גבוהה עדיפה עבור מחקרים מרובים או בנפח גבוה כגון סינון תרופות. מגבלה נוספת היא הצורך בהדמיה, כגון הדמיה קונפוקלית, לניתוח נתונים. בעוד שההדמיה מאפשרת ניתוח מיוחד וזמני מפורט, היא גם גוזלת זמן ומעוכבת על ידי מגבלות חדירה עקב עומק וצפיפות תאים ספרואידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי קרנות הזנק שסופקו לד"ר סילביה פ זוסטיאק על ידי אוניברסיטת סנט לואיס, כמו גם על ידי מענק זרע ממרכז הנרי ואמיליה נסראללה למדעי המוח באוניברסיטת סנט לואיס שהוענק לד"ר סילביה פ זוסטיאק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Fisher Scientific  LC22210-4
15 mL Conicals FALCON 352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates Fisher Scientific 07-200-602
35 mm Petri Dish Amazon 706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) Laysan Bio ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals Fisher Scinetific 3181345107
6-well AggreWell 400  StemCell Technologies, Vancouver, Canada 34421 Square pyramidal microwells 
anti-adherence rinsing solution StemCell Technologies, Vancouver, Canada Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Chemical Fume Hood KEWAUNEE 99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free  Corning 356234 Basement membrane matrix
Detergent - Triton-X Sigma Aldrich T8787 Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific  BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Fisher Scinetific 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum HyClone SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution Sigma Aldrich F1635
Glass Plates Slumpys GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes Fisher Scinetific 5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Hemacytometer Bright-Line 383684
Hydrophobic solution - Repel Silane  GE Healthcare Bio-Sciences 17-1332-01
Incubator NUAIRE NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25) Zeiss 663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) Fisher Scientific  D1125
Leica Confocal SP8 Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) Zeiss 3820005619
Micro centrifuge tubes Fisher Scientific 2 mL: 02681258
Microscope Software Zeiss AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594  Santa Cruz Biotechnology sc-23927
Parafilm PARAFILM  PM992
PBS (1x), pH 7.4 HyClone SH30256.01
Penicillin Streptomycin MP Biomedicals 1670046
Pipette Aid Drummond Scientific Co. P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) Fisher Scinetific 2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL) Amazon  mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) Laysan Bio SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] Elsworth Adhesives 3097358-1004 Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves Quest 92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.  Fisher Scientific  AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x) HyClone SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm Grace Bio-Labs JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488  Santa Cruz Biotechnology sc-365823
Tissue Culture Hood NUAIRE NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)  Sigma Aldrich 90279
U-87 MG human glioblastoma cells American Type Culture Collection  HTB-14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  2. Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417 (2018).
  3. Li, Y., Kumacheva, E. Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening. Science Advances. 4 (4), eaas8998 (2018).
  4. Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids. Polymers. 12 (11), 2506 (2020).
  5. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  6. Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).
  7. Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).
  8. Pedron, S., et al. Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens. Biomaterials. 219, 119371 (2019).
  9. Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids. Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).
  10. Chen, J. -W. E., et al. Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346 (2020).
  11. Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling. Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980 (2018).
  12. Shin, S., et al. Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation. RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).
  13. Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
  14. Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture. Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).
  15. Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells. PLoS One. 14 (1), e0211078 (2019).
  16. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665 (2013).
  17. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).
  18. Zhao, L., et al. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Scientific Reports. 9 (1), 19717 (2019).
  19. Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
  20. Gencoglu, M. F., et al. Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).
  21. Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. Mechanical properties of brain tissue based on microstructure. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924 (2021).
  22. Alifieris, C., Trafalis, D. T. Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment. Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).
  23. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  24. Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).
  25. Kroger, S. M., et al. Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation. Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085 (2020).
  26. Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration. Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).
  27. Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels. Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).
  28. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  29. Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics. MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).
  30. Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).
  31. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948 (2016).
  32. Lee, K. -H., Kim, T. -H. Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening. Biosensors. 11 (11), 445 (2021).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 199 אנקפסולציה הידרוג'ל פוליאתילן גליקול מחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה אנקפסולציה תלת ממדית מיקרו-סביבה גידולית צמיחת תאים מודל חוץ גופי מודל גליובלסטומה תבניות מיקרווול פירמידליות גדלים מבוקרים פולידימתילסילוקסן הידרוג'לים מבוססי PEG תכונות הידרוג'ל נוקשות יכולת התפרקות הדבקת תאים הידרוג'ל רך צביעה מיקרוסקופיה קונפוקלית ליבה ספרואידית פריפריה תמיסת ניקוי
ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bruns, J., Nejat, S., Faber, A.,… More

Bruns, J., Nejat, S., Faber, A., Zustiak, S. P. Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions. J. Vis. Exp. (199), e65515, doi:10.3791/65515 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter