Overview
Under levende avbildning av C. eleganskan en agarosepute brukes til å holde nematoden stille uten å skade eller tørke den. Denne videoen beskriver hvordan du klargjør en enkel monteringspute for mikroskopi.
Protocol
Denne protokollen er hentet fra Teoh et al, Kvantitative tilnærminger for å studere cellulære strukturer og organellemorfologi i Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Forberedelse av lysbilder for avbildning
- Forbered 3-4% m / v agarose lager i en mikrobølgesikker flaske (3-4 g i 100 ml ultrarent vann).
MERK: Agar kan brukes i stedet for agarose i samme konsentrasjon. - Smelt agarose forsiktig i en mikrobølgeovn, pass på at du ikke overkoker, til alle agarose oppløses (klar løsning). Hold oppløsningen ved 70 °C for å forhindre størkning.
MERK: Agarose lager kan brukes flere ganger. Varmes opp igjen før bruk hvis agarose har størknet. - Bruk en Pasteur pipette, plasser en dråpe smeltet agarose på et mikroskop lysbilde.
MERK: Unngå å ha luftbobler i dråpen av agar, da disse forstyrrer integriteten til puten. - Trykk straks ned agarosedråpen med et annet mikroskopsklie, og flat forsiktig sammen agaroseen til en pute mellom de to lysbildene.
MERK: Eventuelle rester av bobler bør fjernes på dette stadiet. Hvis ikke, bør nye lysbilder gjøres da dyr lett kan sitte fast i boblene. Unngå overløp av agar til siden når du trykker på lysbildet. - La agarose tørke i 1 min.
- Separer forsiktig de to lysbildene for å unngå skade på agarose, mens du lar den størkne puten stå på en av lysbildene.
MERK: Lysbilder med agarose pads bør alltid tilberedes friskt like før eksperimentet, da de kan tørke ut. Kontroller at agaroseputen har en jevn tykkelse. Det bør ikke være luftbobler eller sprekker i puten, da dette kan forstyrre avbildningen. - Tilsett en liten dråpe (5-10 μL) på 0,05% tetramisolhydroklorid (bedøvelse) i midten av agaroseputen.
- Ved hjelp av varmesterilisert plukk, overfør raskt ca 10 - 15 dyr fra lagerplaten til bedøvelsesdråpen før løsningen tørker ut. Unngå å overføre for mye OP50-bakterier, da dette gjør løsningen overskyet, noe som kan forstyrre avbildningen.
MERK: Hvis bedøvelsesløsningen tørker ut mens du plukker, bare pipette en andre dråpe på 0,05% tetramisolhydroklorid på dyrene. Dyrene har en tendens til å ligge på sidesiden i bedøvelsesløsningen. - Påfør en deksleslip ved å plassere den like over agaroseputen og forsiktig slippe den ned. Dette vil forhindre dannelse av bobler. Ikke legg press på dekslene, da dette kan knuse dyrene.
- Merk lysbildene med strekknavnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |