Summary
一个实验性肺转移和CTL免疫小鼠模型的肿瘤细胞- T细胞相互作用分析
Abstract
实验转移小鼠模型是一个简单的,但有关生理转移模型。肿瘤细胞静脉注射(四)为小鼠尾静脉和殖民,从而在肺部,类似肿瘤细胞自发转移的最后步骤:在流通领域,外渗及远端器官的殖民化的生存。从治疗的观点来看,实验转移模型是最简单和理想的模式,自疗法的目标往往是:建立在远端器官的转移瘤的转移终点。在此模型中,肿瘤细胞注射四到小鼠尾静脉,并允许在肺部进行殖民和增长。然后注入肿瘤特异性CTL转移轴承鼠标第四。肺转移的数量和大小,可以控制被注入肿瘤细胞的数量和肿瘤生长的时间。因此,各个阶段的转移,从最小的转移到全身广泛转移,可为蓝本。肺转移,从而允许更容易直观地观察和定量分析与油墨的通货膨胀。
Protocol
1。实验转移小鼠模型
- 前一天的肿瘤细胞的注射剂,种子之一T75容量瓶中,用高达1 × 10 7 CMS4了10 mL的RPMI培养基中含有10%的血清,以获得快速增长的肿瘤细胞中的细胞。过夜孵育在37 ° C。
- 在注射当天,去除培养基,用PBS冲洗细胞一次,然后用0.05%胰酶EDTA收获肿瘤细胞在37 ° C为5分钟。停止与10 mL的RPMI培养基中含有10%血清中反应。细胞转移到锥形管。
- 分拆为3分钟,在室温下在Sorvall传奇RT离心机在1300 rpm的细胞。去除上清。重悬在10毫升的新鲜1X的HBSS洗细胞,然后降速再次重悬在以同样的方式。
- 血球计数肿瘤细胞。在HBSS中稀释的细胞,所以,每次注射所需的细胞悬浮在总体积100μL。
- 在温水中浸泡一个烧杯的尾静脉扩张,暖在6-8周龄BALB / c小鼠。鼠标放置在一个板凳上的尾静脉限位。使用microsyringe尾静脉注入100μL的肿瘤细胞。使用无菌技术操作,以避免感染。注射后,适用于注射部位轻微的压力,直到出血停止。
- 返回鼠标笼子,使肿瘤生长所需的阶段。
2。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的过继转移免疫
- 在转移的当天,吸管上下以重悬纯化的细胞毒性T淋巴细胞,或CTL的准备,如文中所述,。所有的细胞从一个板块转移到15 mL锥形管,不要让音量超过超过2 / 3管。
- 无菌巴斯德吸管插入锥管和奠定下细胞的淋巴细胞分离液,或LSM,直到总量接近14毫升。
- 要小心,不要去打扰层。在室温下20分钟在2000转离心。不要使用制动快后慢,旋转转子。
- 转移到一个新的15 mL锥形管的CTL。容积约10毫升加入HBSS洗。
- 细胞计数。在室温下5分钟1300转离心。重悬在HBSS中所需的细胞密度注射,每次注射总量保持在100μL。
- 前面看到的那样在这个视频中注入荷瘤小鼠的CTL,使用相同的尾部注射技术。
- 返回鼠标笼子,让CTL的互动与肿瘤。老鼠通常牺牲的CTL治疗后14-21天进行分析。
3。肺转移的可视化
- 为了直观肺转移,一个牺牲的鼠标在其上的一个泡沫塑料板的背面。 PIN的腿,以确保通畅进入气管。喷雾用70%乙醇的腹侧方。
- 从中旬腹部开始,用剪刀沿中线切,通过胸腔,向唾液腺。公开气管。使用镊子,以消除气管周围的组织。
- 线程下面的气管200μL枪头。一只手握住一角,轻轻气管和远离身体。
- 平台旋转180 °。使用50 ml注射器注入印度墨水肺部通过气管。完全与油墨的肺部膨胀,直到你感到强烈的抵触情绪。
- 用剪刀剪开气管。肺部下一双镊子滑动,并解除他们的鼠标。简要1L烧杯中的水冲洗肺部。
- 在化学通风柜,肺部转移到闪烁的玻璃小瓶含5毫升的Fekete的解决方案。几分钟后,肿瘤组织会出现白色上黑色的肺部结节。肿瘤,现在可以计算和存储在无限期的Fekete的解决方案。
4。在可视化的肺代表转移
- 在这里,从与乳腺癌细胞株4T1注入小鼠的肺部显示白色斑点,说明肿瘤。一个IRF8显性负突变K79E的转染4T1细胞注射的小鼠肿瘤细胞的增强的转移潜能。
- 这些图像显示CTL过继转移免疫组织学疗效分析。注射用生理盐水荷瘤小鼠表现为多发性肿瘤6天后,黄色箭头(一)表示。另一方面,表现出与肿瘤特异性T细胞注入小鼠体内,减少了肿瘤(二)。
- 在相同的实验,墨汁治疗提供了一个简单的方法来衡量CTL过继转移的疗效。在这里,白荷瘤肺肿瘤结节明显区别于他们已成功地进行CTL过继转移,结节计数肺部允许学位定量不可能与组织学。
5。代表性的成果
图1为实验肿瘤的转移和CTL的适应性转移免疫小鼠模型的试验计划。红色圆点表示肿瘤细胞和绿色圆点表示的CTL。
图2中断IRF8功能增强对肿瘤细胞的转移潜能。稳定转染的小鼠乳腺癌细胞株4T1载体(4T1.Vector)或向量表示一个IRF8显性负突变K79E(4T1.IRF8K79E)(15,16)。鼠标横向尾静脉注射四到肿瘤细胞。荷瘤肺膨胀与印度墨水可视肿瘤结节。肿瘤结节很容易被看作是黑色的肺组织背景上的白色斑点。
图3。CTL过继转移免疫组织学疗效分析。鼠标横向尾静脉注入小鼠肉瘤细胞株CMS4 - Met的第四。三天后,生理盐水(A)或肿瘤特异性T细胞(B)分别注入荷瘤小鼠。常规H&E染色组织学染色CTL治疗后6天,肺部进行了分析。肿瘤结节是由箭头指示。
图4。墨汁通胀的肿瘤结节的可视化。鼠标横向尾静脉注入小鼠肉瘤细胞株CMS4 - Met的第四。三天后,生理盐水(对照)或肿瘤特异性T细胞(+ CTL)分别注入荷瘤小鼠。的CTL治疗14天后,肺部进行了分析。白点,这是肿瘤结节,允许容易量化的CTL治疗的疗效。
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Disclosures
小鼠购自美国国家癌症研究所(Friderick,MD)和住在医学院格鲁吉亚动物设施。实验和关怀/福利协议联邦法规和医学院格鲁吉亚IACUC委员会批准的协议。
Acknowledgments
由美国国立卫生研究院(CA133085吉隆坡)和美国癌症协会的资助(RSG - 09 - 209 - 01 - TBG的吉隆坡)支持。
Materials
Solutions: |
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India Ink Solution (17): |
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Fekete's Solution (17): |
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Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues. |
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References
- Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope. J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).
- Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases. J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).
- Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape. J Immunol. 176 (6), 3374-3382 (2006).
- Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression. International journal of cancer. 122 (2), 350-362 (2008).
- Pages, F., Berger, A., Camus, M. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353 (25), 2654-2666 (2005).
- Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-194 (2006).
- Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease. Gut. 54 (5), 661-665 (2005).
- Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence. Cancer research. 69 (6), 2685-2693 (2009).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol. 23 (10), 2346-2357 (2005).
- Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research. 70 (1), 68-77 (2010).
- Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells. Cancer research. 68 (8), 2561-2563 (2008).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature reviews. 9 (4), 274-284 (2009).
- Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Digestive surgery. 22 (1-2), 1-2 (2005).
- Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression. Clin Cancer Res. 13 (17), 5202-5210 (2007).
- Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression. J Immunol. 179 (7), 4775-4782 (2007).
- Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells. Cancer research. 67 (7), 3301-3309 (2007).
- Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).