הפעילות של decarboxylase ועין מתנהלת ליזין מנוטר על ידי מגיבים המצע L-ליזין לבין המוצר קדברין עם חומצה 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-לטופס adducts כי יש מסיסות ההפרש ב טולואן.
Escherichia coli הוא חיידק enteric כי הוא מסוגל לגדול על פני טווח רחב של ערכי ה-pH (pH 5-9) 1, לא ייאמן, הוא מסוגל לשרוד חומצה קיצונית מדגיש כולל מעבר דרך הקיבה יונקים שבו pH יכול ליפול נמוך כמו pH פבואר 01-02. כדי לאפשר כזה מגוון רחב של הישרדות pH חומצי, א coli בעלת ארבעה שונה ועין מתנהלת חומצה אמינית decarboxylases כי המצע שלהם decarboxylate חומצות אמינו בצורה פרוטון תלויי ובכך להעלות את ה-pH הפנימי. Decarboxylases כוללים חומצה גלוטמית decarboxylases GadA ו GadB 3, decarboxylase ארגינין עדיה 4, decarboxylase ליזין LdcI 5, 6 ו decarboxylase ornithine SpeF 7. כל אנזימים אלה לנצל pyridoxal-5'-phospate כגורם משותף 8 ולתפקד יחד עם המצע מוצר antiporters-הקרום הפנימי להסיר מוצרים decarboxylation למדיום חיצוני תמורת מצע טרי 2. במקרה של LdcI, antiporter ליזין-קדברין נקרא CadB. לאחרונה, אנו נקבע את מבנה רנטגן של גביש LdcI ל 2.0, ואנו גילו מולקולה קטנה, רומן חייב LdcI התגובה מחמירים הרגולטור guanosine 5'-diphosphate, diphosphate 3'-(ppGpp) 14. התגובה מחמירים מתרחשת כאשר התאים גדל באופן אקספוננציאלי ניסיון חסך תזונתי או אחת למספר מדגיש אחרים 9. כתוצאה מכך, התאים לייצר ppGpp שמוביל מפל איתות ששיאה במעבר גידול מעריכי לגידול שלב נייח 10. אנחנו הוכיחו כי ppGpp הוא מעכב ספציפי של LdcI 14. כאן אנו מתארים את assay decarboxylase ליזין, שונה מן assay שפותחה על ידי Phan et al. 11, שיש לנו כדי לקבוע את הפעילות של LdcI והשפעת pppGpp / ppGpp על פעילות זו. התגובה decarboxylation LdcI מסיר את קבוצת α-carboxy של L-ליזין מייצרת פחמן דו חמצני קדברין polyamine (1,5-diaminopentane) 5. L-ליזין קדברין ניתן הגיבו 2,4,6-trinitrobenzensulfonic חומצה (TNBS) ב-pH גבוה כדי לייצר N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין), בהתאמה 11. TNP-קדברין ניתן להפריד TNP-ליזין כמו לשעבר הוא מסיס בממסים אורגניים כגון טולואן בזמן האחרון הוא לא (ראו תרשים 1). טווח ליניארי של assay נקבע באופן אמפירי באמצעות מטוהרים קדברין.
ב assay decarboxylase ליזין, TNBS הוא הגיב עם אמינים העיקרי של L-ליזין קדברין כדי ליצור TNP-ליזין TNP-קדברין adducts (איור 1). בשל נוכחותם של הקבוצה חומצה carboxylic על TNP-ליזין, adduct זה נשאר מסיסים במים בעוד TNP-קדברין, חסרה הקבוצה חומצה carboxylic, הוא מסוגל מחיצות לתוך טולואן 11. סוג זה של assay יכו…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד"ר ד"ר מיכאל קאשל (National Institutes of Health, Bethesda, מסצ'וסטס, ארה"ב) לשליחת לנו זני חיידקים, פלסמידים, ופרוטוקולים הצורך. אנו מודים לד"ר ג'ון גלובר (המחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת טורונטו) לשימוש של הקורא צלחת SpecraMax. בבריטניה הוא מקבל הלאומית למדעים והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) מלגות לתארים מתקדמים, המכון הקנדי של תוכנית הבריאות הדרכה אסטרטגי מחקר בביולוגיה מבנית של חלבונים בממברנה הקשורים למחלה, וכן אוניברסיטת אחוות פתח טורונטו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לחקר הבריאות (MOP-67210) כדי וואה.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
96-well quartz plate | Hellma | |||
VWR Digital Heatblock | VWR | |||
ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |