Un test per misurare l'attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase
Summary
L'attività della decarbossilasi inducibile lisina è monitorato facendo reagire il substrato L-lisina e il prodotto cadaverina con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acido per formare addotti che hanno solubilità differenziale in toluene.
Abstract
Escherichia coli è un batterio intestinale che è in grado di crescere in un ampio intervallo di valori di pH (pH 5 – 9) 1 e, incredibilmente, è in grado di sopravvivere acido estrema sottolinea anche il passaggio attraverso lo stomaco dei mammiferi in cui il pH può scendere al livello più basso come pH 1 – 2 2. Per consentire ad una vasta gamma di sopravvivenza a pH acido, E. coli possiede quattro diversi decarboxylases aminoacido inducibile che decarbossilano loro substrato amino acidi in un protone-dipendente aumentando così il pH interno. Il decarboxylases includono il acido glutammico decarboxylases Gada e GadB 3, l'arginina decarbossilasi Adia 4, la lisina decarbossilasi LdcI 5, 6 e l'ornitina decarbossilasi SpeF 7. Tutti questi enzimi utilizzano piridossale-5'-fosfato come co-fattore 8 e funzione con membrana interna substrato-prodotto antiporters che rimuovono i prodotti decarbossilazione al supporto esterno in cambio di substrato fresco 2. Nel caso di LdcI, la lisina-cadaverina antiporter si chiama Cadb. Recentemente, abbiamo determinato la struttura a raggi X di cristallo di LdcI a 2.0 Å, e abbiamo scoperto un romanzo piccole molecole legato LdcI il severo guanosina regolatore risposta 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp) 14. La risposta rigorosa verifica quando le cellule in crescita esponenziale esperienza privazione nutritiva o uno di una serie di sollecitazioni di altri 9. Di conseguenza, le cellule producono ppGpp che porta ad una cascata di segnali si conclude con il passaggio da una crescita esponenziale alla crescita fase stazionaria 10. Abbiamo dimostrato che ppGpp è un inibitore specifico della LdcI 14. Qui descriviamo il test lisina decarbossilasi, modificato dal test sviluppato da Phan et al. 11, che abbiamo usato per determinare l'attività di LdcI e l'effetto di pppGpp / ppGpp su tale attività. La reazione di decarbossilazione LdcI rimuove l'α-carbossi gruppo di L-lisina e produce anidride carbonica e la cadaverina poliammine (1,5-diaminopentane) 5. L-lisina e cadaverina si può reagire con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acido (TNBS) a pH elevato per generare N, N-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), rispettivamente 11. Il TNP-cadaverina può essere separato dal TNP-lisina in quanto il primo è solubile in solventi organici come il toluene, mentre la seconda non lo è (vedi figura 1). Il range lineare del test è stato determinato empiricamente utilizzando purificata cadaverina.
Protocol
Discussion
Nel test lisina decarbossilasi, TNBS viene fatto reagire con le ammine primarie di L-lisina e cadaverina per formare TNP-lisina e TNP-cadaverina addotti (Figura 1). A causa della presenza del gruppo carbossilico sul TNP-lisina, questo addotto rimane solubile in acqua, mentre il TNP-cadaverina, manca il gruppo carbossilico, è in grado di partizionamento in toluene 11. Questo tipo di analisi può essere utilizzata più ampiamente su altri tipi di aminoacidi in cui la perdita di un gruppo carbossilico si verifi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) per averci inviato ceppi batterici, plasmidi e protocolli necessari. Ringraziamo il Dr. John Glover (Dipartimento di Biochimica, Università di Toronto) per l'utilizzo del lettore di piastre SpecraMax. Regno Unito è il destinatario di una Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council del Canada (NSERC) Borsa di studio post-laurea, un Canadian Institutes of Research Program Formazione Salute strategica nella biologia strutturale delle proteine di membrana collegato a malattie, e una borsa di studio dell'Università di Toronto Open. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) per WAH.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
Referências
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