In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen
Summary
In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.
Abstract
In-vitro-Studie der primären neuronalen Kulturen ermöglicht quantitative Analysen von Neuriten. Um zu untersuchen, wie genetische Veränderungen neuronaler Prozess Auswuchs, shRNA-oder cDNA-Konstrukte können in primären Neuronen über chemische Transfektion oder virale Transduktion eingeführt werden beeinträchtigt. Doch mit primären kortikalen Zellen sind eine heterogene Pool von Zelltypen (glutamatergen Neuronen aus verschiedenen Schichten, hemmenden Neuronen, Gliazellen) transfiziert mit diesen Methoden. Die Verwendung von in utero Elektroporation DNA-Konstrukte in der embryonalen Nagetier Kortex vorstellen können für bestimmte Untergruppen von Zellen gezielt zu: Während die Elektroporation von frühen embryonalen Kortex Ziele tiefen Schichten der Hirnrinde, Ziele Elektroporation am späten embryonalen Zeitpunkten mehr oberflächlichen Schichten. Darüber hinaus Differential Platzierung der Elektroden über die Köpfe der einzelnen Embryonen Ergebnisse in der Ausrichtung der dorsal-medial gegen ventral-lateralen Regionen des Kortex. Nach der Elektroporation können transfizierte Zellen aus zerlegt werden, dissoziiert und vernickelt in vitro für die quantitative Analyse von Neuriten. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Methode zur quantitativen Messung neuronaler Prozess Auswuchs in Teilmengen von kortikalen Zellen.
Das grundlegende Protokoll für die in utero Elektroporation wurde im Detail in zwei anderen JoVE Artikel aus dem Kriegstein Labor 1, 2 beschrieben. Wir geben einen Überblick über unser Protokoll für in utero Elektroporation, die sich auf die wichtigsten Details, durch eine Beschreibung unseres Protokoll, das in utero Elektroporation gilt für die Untersuchung von Genfunktionen in neuronalen Prozess Auswuchs gefolgt.
Protocol
Discussion
In-vitro-Studie der primären neuronalen Kulturen ermöglichen quantitative Analysen von Neuriten. Um zu untersuchen, wie genetische Veränderungen neuronaler Prozess Auswuchs beeinflussen können shRNA oder misexpression Konstrukte in primären Neuronen über chemische Transfektion oder virale Transduktion eingeführt werden. Doch mit primären kortikalen Zellen sind eine heterogene Pool von Zelltypen (glutamatergen Neuronen aus verschiedenen Schichten, hemmenden Neuronen, Gliazellen) transfiziert mit diesen M…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Joseph LoTurco und Dennis Selkoe für hilfreiche Diskussionen über diese Technik zu danken. Die Autoren danken den Spendern der American Health Assistance Foundation, für die Unterstützung dieser Forschung.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
Referências
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
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- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
