En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales
Summary
En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o de vitro para los efectos de la alteración genética.
Abstract
Estudio de vitro de cultivos primarios de neuronas permite un análisis cuantitativo de crecimiento de las neuritas. Con el fin de estudiar cómo las alteraciones genéticas afectan a consecuencia proceso neuronal, shRNA o construcciones de ADNc se pueden introducir en las neuronas primarias a través de la transfección químicos o transducción viral. Sin embargo, con células de la corteza primaria, un grupo heterogéneo de tipos de células (neuronas glutamatérgicas de diferentes capas, las neuronas inhibidoras, las células gliales) se transfectaron usando estos métodos. El uso de la electroporación en el útero para introducir construcciones de ADN en la corteza roedores embrionarias permite ciertos subconjuntos de células para ser específicos: mientras que la electroporación de los primeros objetivos de embriones corteza capas profundas de la corteza, la electroporación a finales de los puntos de tiempo embrionarias objetivos de las capas más superficiales. Además, la colocación de electrodos diferenciales a través de las cabezas de los resultados de embriones individuales en la focalización de las regiones dorsal-ventral medial frente al lateral de la corteza. Después de la electroporación, las células transfectadas se disecaron, disociados, y se colocaron in vitro para el análisis cuantitativo de crecimiento de las neuritas. Aquí, ofrecemos un método paso a paso para medir cuantitativamente consecuencia proceso neuronal en los subconjuntos de células corticales.
El protocolo básico para la electroporación en el útero ha sido descrito en detalle en dos artículos JoVe otros del laboratorio Kriegstein 1, 2. Vamos a ofrecer una visión general de nuestro protocolo de electroporación en el útero, se centra en los detalles más importantes, seguido de una descripción de nuestro protocolo que se aplica pt la electroporación in utero al estudio de la función de genes en consecuencia el proceso neuronal.
Protocol
Discussion
En el estudio in vitro de cultivos neuronales primarios permiten análisis cuantitativos de crecimiento de las neuritas. Con el fin de estudiar cómo las alteraciones genéticas afectan a consecuencia proceso neuronal, las construcciones del shRNA o misexpression se pueden introducir en las neuronas primarias a través de la transfección químicos o transducción viral. Sin embargo, con células de la corteza primaria, un grupo heterogéneo de tipos de células (neuronas glutamatérgicas de diferentes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a José LoTurco y Dennis Selkoe útil para los debates sobre esta técnica. Los autores agradecen a los donantes de la Fundación de Asistencia para la Salud de América, para el apoyo de esta investigación.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
Referências
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
