In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux
Summary
Électroporation de utero est une méthode utile pour transfecter des cellules progénitrices neuronales in vivo. Selon le placement des électrodes et la période de développement de l'électroporation, certains sous-ensembles de cellules corticales peuvent être ciblées. Cellules ciblées peuvent ensuite être analysées in vivo ou de vitro des effets de l'altération génétique.
Abstract
Dans l'étude in vitro de cultures primaires de neurones permet une analyse quantitative de la croissance des neurites. Afin d'étudier comment des altérations génétiques affectent excroissance processus neuronaux, shRNA ou des constructions d'ADNc peuvent être introduits dans les neurones primaires via la transfection chimiques ou transduction virale. Cependant, avec des cellules primaires du cortex, une piscine hétérogène de types de cellules (neurones glutamatergiques de différentes couches, les neurones inhibiteurs, les cellules gliales) sont transfectées en utilisant ces méthodes. L'utilisation d'électroporation de utero à introduire les constructions d'ADN dans le cortex des rongeurs embryonnaire permet de certains sous-ensembles de cellules d'être la cible: alors que l'électroporation de début des cibles du cortex embryonnaire couches profondes du cortex, électroporation à la fin de timepoints embryonnaire cibles couches les plus superficielles. En outre, le placement des électrodes différentielles travers les têtes des résultats individuels des embryons dans le ciblage des régions dorso-ventrale par rapport médial-latéral du cortex. Après électroporation, les cellules transfectées peuvent être disséquées, dissocié, et plaqué in vitro pour l'analyse quantitative de la croissance des neurites. Ici, nous fournissons une méthode, étape par étape pour mesurer quantitativement excroissance processus neuronaux sous-ensembles de cellules corticales.
Le protocole de base pour électroporation de utero a été décrite en détail dans deux articles JoVE d'autres du laboratoire Kriegstein 1, 2. Nous allons donner un aperçu de notre protocole d'électroporation de utero, en se concentrant sur les détails les plus importants, suivie par une description de notre protocole qui s'applique électroporation de utero à l'étude de la fonction des gènes dans le processus d'excroissance neuronale.
Protocol
Discussion
Dans l'étude in vitro de cultures primaires de neurones permettent des analyses quantitatives des neurites. Afin d'étudier comment des altérations génétiques affectent excroissance neuronale processus, des constructions ou des shRNA misexpression peuvent être introduits dans les neurones primaires via la transfection chimiques ou transduction virale. Cependant, avec des cellules primaires du cortex, une piscine hétérogène de types de cellules (neurones glutamatergiques de différentes couches, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Joseph LoTurco et Dennis Selkoe pour des discussions utiles sur cette technique. Les auteurs remercient les donateurs de la Fondation d'aide de la Santé, pour le soutien de cette recherche.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
Referências
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
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- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
