Summary
Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.
Abstract
Esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica do sistema nervoso central (SNC), que comumente afeta adultos jovens. É caracterizada por desmielinização e assustando glial em áreas disseminadas no cérebro e medula espinhal. Essas lesões alterar a condução nervosa e induzir a déficits neurológicos incapacitantes que variam com a localização das placas de desmielinização no SNC (por exemplo, paraparesia, paralisia, cegueira, incontinência).
Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo para MS. EAE foi induzida acidentalmente em humanos durante a vacinação contra a raiva, usando vírus cultivados em coelho medula espinhal. Resíduos de injeção espinhal com o vírus inativado induziram a doença do SNC. Seguindo essas observações, o primeiro modelo da EAE foi descrita em primatas não-humanos imunizados com um CNS homogeneizado por Rivers e Schwenther em 1935. EAE desde então tem sido gerada em uma variedade de espécies e pode seguir cursos diferentes, dependendo da espécie / estirpe e imunizando antígeno utilizado. Por exemplo, imunizando ratos Lewis com proteína básica da mielina em emulsão com adjuvante induz um modelo aguda da EAE, enquanto o mesmo antígeno induz a uma doença crônica em cobaias.
O modelo de EAE aqui descrito é induzida através da imunização contra ratos DA DA medula espinhal de ratos em emulsão em adjuvante de Freund completo. Ratos desenvolvem uma paralisia flácida ascendente dentro de 7-14 dias pós-imunização. Sinais clínicos seguir um curso remitente-recorrente durante várias semanas. Patologia mostra grandes infiltrados imunológico no SNC e placas de desmielinização. Considerações especiais para cuidar de animais com EAE são descritos no final do vídeo.
Protocol
Indução e monitorização de EAE crónica recidivante
A emulsão é uma mistura 1:1 do antígeno em solução aquosa adicionado ao complementada adjuvante de Freund completo. É muito importante adicionar o antígeno ao adjuvante e não o contrário!
Há uma grande quantidade de resíduos ao fazer e injetando uma emulsão. Sempre preparar 1,5 ou 2 vezes mais do que o que você precisa.
Use argamassa autoclavado, pilão, seringas de vidro, e pontes. Todos os plásticos devem ser estéreis. A preparação pode ser feito em uma bancada de laboratório regular.
1. Preparação do adjuvante complementado
Pesar 30 mg de Mycobacterium tuberculosis (Difco catalogo 231.141) e coloque em um pilão. Transformar em pó fino sem pressionar demasiado duro para evitar quebrar as bactérias. Adicionar 10 ml de adjuvante completo de Freund H37Ra (Difco catalogo 231.131) e misturar. Este adjuvante complementada agora contém 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Transferir para um tubo.
2. Preparação do homogenato medula espinhal
Coletar medula espinhal de ratos DA (idade / sexo indiferente) e armazenar congelado a -80 ° C. Pesar os cabos congelados espinhal para ter o suficiente para mistura 1:1 (peso: volume) com o adjuvante suplementado. Picar a medula espinhal mais fino possível com uma lâmina de barbear, a transferência para a argamassa usada na seção 1, e fazer um colar com o pilão.
3. Preparação da emulsão
- Lugar complementada completa adjuvante de Freund em um tubo. Vortex em alta velocidade. Adicionar a queda da medula espinhal homogeneizado a gota enquanto vórtex. Quando todos os homogeneizado medula espinhal é adicionada vórtice, por mais 5 minutos. A mistura deve virar rosa claro.
- Coloque a emulsão em uma seringa de vidro de 5 ml e vinculá-lo para outra seringa de vidro 5 ml usando uma ponte de 18G (Fisher catálogo # 14-825-17L). Enviar a emulsão de uma seringa para o outro até que se torne rígido (5-10 min). Se mais de 5 ml de emulsão é preparada, use várias seringas 5 ml NÃO use seringas maiores.
- A emulsão pode ser armazenada nas seringas a 4 ° C por 3 semanas. Eu recomendo prepará-la pelo menos 12 horas de antecedência para verificar se ele não quebrar. Ele deve permanecer espessa e não separados em duas fases. A cor irá mudar durante a noite para uma luz amarela ou bege.
4. Imunização dos ratos
- Misture a emulsão nas seringas por alguns minutos e transfira para a seringa utilizada para a injeção. Injetar 200 mL por via subcutânea na própria base da cauda usando agulhas 23G e 3 ml seringas Luer-Lock em curto prazo anestesia.
- Os destinatários são 7-9 semanas de idade ratas DA. Ficamos com nossos ratos de Harlan Sprague Dawley-.
- Ratos devem ser observadas duas vezes por dia e pesados diariamente. Os sinais clínicos são esperados 7-15 dias após a injeção da emulsão.
Pontuação clínica:
0: sem doença
0.5: cauda limp distal
Um: tail limp
2: paraparesia leve, ataxia
3: paraparesia moderada, as viagens ratos de vez em quando
3.5: um dos membros posteriores é paralisado, os outros movimentos
4: paralisia de membros posteriores completo
5: paralisia de membros posteriores e completa incontinência
6: dificuldade em respirar moribunda, não comer ou beber. Euthanize imediatamente.
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Discussion
Há algumas considerações importantes para este protocolo.
Genética de ratos DA diferem ligeiramente dependendo do criador, elas são compradas a partir de. Estas diferenças podem aumentar ou diminuir a susceptibilidade dos ratos à EAE de indução. Se o seu ratos são mais suscetíveis a EAE você vai querer reduzir a força da imunização usando não suplementadas adjuvante de Freund completo ou mesmo incompleta adjuvante de Freund. Você também pode considerar a redução da quantidade de emulsão injetada ou diluir o homogeneizado da medula espinhal com solução salina antes de preparar a emulsão. Se o seu ratos não desenvolvem sinais clínicos da EAE usando a força total imunizar emulsão verificar a limpeza das suas instalações de habitação. Ratos infectados com parasitas (como pinworm) não irão desenvolver EAE. Você pode considerar a habitação seus animais em condições mais limpas em gaiolas com filtro autoclavado-tops, e dando-lhes acidificados água ad libitum (o protocolo para a elaboração água acidificada é anexado).
A emulsão deve ser água em óleo, de modo que o óleo no adjuvante casaco completamente o antígeno você adicionar gota a gota. Uma emulsão preparada de outra maneira (óleo-em-água) vai se tornar tão espessa, mas não será encephalitogenic.
Os ratos são animais amigáveis, se eles estão acostumados ao seu manipulador, é, portanto, uma boa idéia para segurá-los delicadamente em uma base diária antes da injeção da emulsão encephalitogenic. Isso irá reduzir o estresse eo risco de uma mordida.
Animais com EAE grave (escore de 3 ou mais) precisam de cuidados especiais. Ratos nunca deve ser pego pelo rabo, mas sim pelo corpo. Isto é ainda mais importante para reduzir o estresse em animais doentes. É muito importante assegurar que todos os animais têm acesso a alimentos e água, colocando pacotes de comida e gel na cama e proporcionando longa sipper tubos nas garrafas de água. Ratos com EAE continuarão comendo e bebendo, se uma paragem de animais ou de comer ou beber consultar o veterinário do seu instituto ou eutanásia do animal. Ratos doentes devem ser separados dos animais saudáveis para garantir que eles não estão constantemente espezinhados, mas evite ratos deixando sozinha uma vez que são animais sociais e precisam de companhia.
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Disclosures
CB e KGC são co-fundadores e consultores para Airmid Inc.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Complete Freund’s Adjuvant | Reagent | Fisher Scientific | DF 311-360-5 | Manufactured by Difco |
Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Reagent | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Manufactured by Difco |
DA rat | Animal | Harlan Laboratories | Females, 7-9 weeks old. | |
Glass syringes - 5 ml | Tool | Fisher Scientific | 14-823-10 B | |
Metal bridge - 18G | Tool | Fisher Scientific | 14-825-17L | |
Luer Lok plastic syringes - 3 ml | Tool | BD Biosciences | 309585 | |
Needles - 20G 1 1/2 | Tool | Fisher Scientific | 14-826-5C |