Le ver nématode intensément étudié<em> Caenorhabditis elegans</em> Peut être transgénique conçue pour exprimer la β-amyloïde humaine peptide (Aß). Expression induite de Aß dans le<em> C. elegans</emMusculaire> conduit à une rapide, une paralysie phénotype reproductible qui peut être utilisé pour surveiller les traitements qui modulent la toxicité Aß.
L'accumulation du peptide β-amyloïde (Aß) est généralement considéré comme central pour l'induction de la maladie d'Alzheimer, mais le mécanisme pertinent (s) de toxicité sont encore mal connus. Aßi est également déposée par voie intramusculaire dans myosites à inclusions, une myopathie sévère humaine. Le elegans intensément étudié ver nématode Caenorhabditis transgénique peut être modifié pour exprimer Aßi humaine. Selon le tissu ou le calendrier d'expression Aßi, vers transgéniques peuvent avoir des phénotypes facilement mesurables qui servent comme une lecture de la toxicité Aß. Par exemple, des vers transgéniques à expression pan-neuronal Aßi avoir des défauts est l'apprentissage associatif (Dosanjh et al 2009.), Tandis que les vers transgéniques avec des muscles spécifiques à l'expression constitutive montrent une progressive, dépendant de l'âge phénotype paralysie (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Un particulièrement utile C. elegans modèle emploie une mutation thermosensible dans le système de surveillance à l'ingénieur d'expression d'ARNm musculaire inductible par la température d'un transgène Aßi, résultant en un phénotype de paralysie reproductibles lors de changement de vitesse de la température (Link et al. 2003). Les traitements qui Aßi contrer la toxicité de ce modèle [par exemple, l'expression d'un transgène de protection (Hassan et al. 2009) ou l'exposition à des extraits de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproductible modifier le taux de paralysie induite par monter les rapports de température de ces transgéniques des vers. Nous décrivons ici notre protocole pour mesurer le taux de paralysie dans ce transgéniques C. modèle elegans, avec une attention particulière aux variables expérimentales qui peuvent influencer cette mesure.
Le protocole que nous avons décrits peuvent être utilisés efficacement pour doser les effets des composés sur la toxicité Aß. Publié exemples incluent les effets des constituants d'extrait de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) et la réserpine (Arya et al. 2009). Les composés qui ont été protection contre la toxicité Aßi dans d'autres systèmes ont également été montré pour avoir un effet protecteur dans ce modèle (par exemple, la mémantine, nos résultats non publiés). Une justification importante pour l'établissement de ce modèle est que les outils bien développés génétiques et moléculaires disponibles en C. elegans peut être utilisée pour étudier les mécanismes de toxicité Aß. Ainsi, les mutations des effets spécifiques sur la toxicité Aßi peut être dosée (par exemple, l'effet de réduire insulin-like de signalisation par l'introduction d'un daf-2 avec perte de fonction de mutation, Florez-McClure et al. 2007), et ce modèle peut également être utilisé pour examiner les effets de la sur-expression des transgènes (Fonte et al. 2008). Nous avons récemment fait un large usage de ce modèle pour étudier les effets sur la toxicité de simples substitutions d'acides aminés dans les Aß (données non publiées).
Le modèle transgénique décrite ici l'effet des dosages d'expression Aßi aiguë sur la fonction des cellules musculaires. Au moment de la paralysie des cellules musculaires et de leurs sarcomères sont intacts; le phénotype paralysie n'est pas le résultat de la mort des cellules musculaires. Cependant, après la paralysie (~ 48 heures après la montée des rapports initiaux) il ya une rupture de l'intégrité musculaire et la mort éventuelle des vers. Nous n'avons pas enquêté sur cet effet en aval d'expression Aßi ou utilisé comme un marqueur de toxicité.
Le modèle expression inductible Aßi décrite ici n'est pas appropriée pour enquêter sur les traitements qui modulent β-amyloïde la formation en soi. Bien que les vers transgéniques avec la forme Aßi expression constitutive des dépôts amyloïdes facilement détectables (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), les vers transgéniques à expression inductible Aßi ont rarement des dépôts amyloïdes et le phénotype de paralysie apparaît indépendante des dépôts amyloïdes (Drake et coll. 2003). Nos résultats sont cohérents avec l'idée que la toxicité aiguë de l'expression des résultats induits Aßi de l'accumulation de Aß oligomériques solubles, pas de dépôts amyloïdes.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier les membres actuels et anciens du laboratoire Lien qui a aidé à développer les protocoles décrits ici, en particulier Gin Fonte, qui a développé la procédure initiale. Ce travail a été soutenu par des prix du NIH (AG12423) et l'Association Alzheimer (prix Zenith) au CDL
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |