Transfecteren menselijke neurale stamcellen met de Amaxa Nucleofector
Summary
Het introduceren van een gen van interesse in een cel is een krachtige methode voor het ophelderen van de functie in vivo. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het transfecteren een cultuur van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) met de Nucleofector elektroporatie apparaat gemaakt door Amaxa.
Abstract
Transfectie van primaire zoogdieren neurale cellen, zoals menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), met veel gebruikte kationische lipiden transfectiereagentia heeft vaak geleid tot een slechte levensvatbaarheid van de cellen en de lage transfectie-efficiëntie. Andere mechanische methoden van de invoering van een gen van belang, zoals een gen geweer of micro-injectie, worden ook beperkt door een slechte levensvatbaarheid van de cellen en de lage aantallen van getransfecteerde cellen. De strategie van het gebruik van virale constructen om een exogene gen te introduceren in primaire cellen is beperkt door zowel de hoeveelheid tijd en werk nodig is om virale vectoren en mogelijke veiligheidsproblemen te creëren. We beschrijven hier een stap-voor-stap protocol voor het gebruik van transfecteren hNSPCs Nucleofector apparaat Amaxa en technologie met elektrische stroom parameters en buffer-oplossingen die specifiek geoptimaliseerd voor het transfecteren neurale stamcellen. Met behulp van dit protocol hebben we bereikt de eerste transfectie efficiëntie van ~ 35% en ~ 70% na stabiele transfectie. Het protocol houdt een combinatie van een groot aantal hNSPCs met de DNA getransfecteerd worden in de juiste buffer, gevolgd door elektroporatie met de Nucleofector apparaat.
Protocol
Discussion
Dit protocol beschrijft een relatief snelle en efficiënte procedure voor transfectie hNSPCs. Met behulp van deze procedure, hebben wij de eerste transfectie efficiëntie van ~ 35%. Cellen die zijn getransfecteerd door deze procedure kan worden gebruikt voor korte-termijn studies (transient getransfecteerde cellen) of voor een langere-termijn studies als een selectiemiddel wordt gebruikt om een stabiel getransfecteerde bevolking te genereren. We hebben gegenereerd stabiel getransfecteerde cellen waarin ~ 70% van de cellen drukken de e…
Acknowledgements
De auteurs willen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel erkennen bij de Children's Hospital, Orange County Instituut voor het verstrekken van hNSPC culturen.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
Referências
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
