Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector
Summary
Die Einführung eines Gens in eine Zelle ist eine leistungsfähige Methode für die Aufklärung ihrer Funktion in vivo. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Transfektion von einer Kultur des menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) mit Hilfe der Elektroporation Nucleofector Apparat Amaxa gemacht.
Abstract
Transfektion von primären Säugerzellen neuronalen Zellen, wie die menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), mit häufig verwendeten kationischen Lipid Transfektionsreagenzien oft in armen Lebensfähigkeit der Zellen und geringe Transfektionseffizienz geführt. Andere mechanische Verfahren zur Einführung eines Gens von Interesse, wie eine Gen-Kanone oder Mikroinjektion werden zudem durch eine schlechte Lebensfähigkeit der Zellen und niedrigen Zahlen von transfizierten Zellen begrenzt. Die Strategie der Verwendung von viralen Konstrukte eines exogenen Gens in primären Zellen einzuschleusen wurde sowohl von der Höhe der Zeit und Arbeit erforderlich, um virale Vektoren und mögliche Sicherheitsprobleme zu schaffen gezwungen worden. Wir beschreiben hier eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Transfektion von hNSPCs mit amaxas Nucleofector Gerät und Technologie mit elektrischem Strom Parameter und Puffer-Lösungen speziell für die Transfektion von neuronalen Stammzellen optimiert. Unter Verwendung dieses Protokolls haben wir erste Transfektionseffizienz von ~ 35% erreicht und ~ 70% nach stabiler Transfektion. Das Protokoll beinhaltet die Kombination einer hohen Anzahl von hNSPCs mit der DNA in den entsprechenden Puffer durch Elektroporation mit dem Nucleofector Gerät gefolgt transfiziert werden.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine relativ schnelle und effiziente Verfahren für die Transfektion hNSPCs. Mit diesem Verfahren haben wir zunächst Transfektionseffizienz von ~ 35% erhalten. Zellen, die durch dieses Verfahren transfizierten kann für kurzfristige Studien (transient transfizierten Zellen) oder für eine längerfristige Studien verwendet werden, wenn eine Auswahl Agent wird verwendet, um eine stabil transfizierte Bevölkerung zu generieren. Wir haben stabil transfizierten Zellen, in denen 70% der Zellen ~ drücken die exogene P…
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen auf die Kinder s Hospital, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPC Kulturen anzuerkennen.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
Referências
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
