人类神经干细胞转染与Amaxa Nucleofector
Summary
感兴趣的基因引入细胞，为阐明其在体内的功能强大的方法。这个协议描述一个有效的方法转染人类神经干/前体细胞，使用由Amaxa Nucleofector电设备（hNSPCs）文化。
Abstract
初级哺乳动物的神经细胞，如人类神经干/前体细胞（hNSPCs）常用的阳离子脂质体转染试剂，转染，往往导致不良的细胞活力和转染效率低。其他机械方法引入一个感兴趣的基因，如基因枪或显微注射，也是有限的由差转染细胞的细胞活力和低的数字。利用病毒的结构，引入外源基因的原代细胞的战略受到了制约金额所需的时间和劳动，创建病毒载体和潜在的安全问题。我们在这里描述为转染hNSPCs使用Amaxa Nucleofector设备和技术，专门用于优化转染神经干细胞与电流的参数和缓冲溶液的一步一步的协议。使用此协议，我们已经取得了最初的转染效率〜35％和〜70％的稳定转染后。该协议需要相结合，要在适当的缓冲区Nucleofector设备电转染的DNA的hNSPCs高。
Protocol
注：请参阅的传代人类神经干细胞的文章（ https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）和点票人类神经干细胞的文章（ https://www.jove.com /指数/ Details.stp？ID = 262 ），以了解如何重悬并计数hNSPCs。 制备确保有大量可用于转染的细胞（几百万的每个DNA的细胞转染）。 外套的组…
Discussion
这一协议描述为hNSPCs相对快速，高效的的转染过程。使用此过程中，我们已取得了初始转染效率〜35％。此过程中的转染细胞，可用于短期研究（瞬时转染的细胞）或较长期的研究中，如果选择代理是用来产生一个稳定转染的人口。我们已经产生了稳定转染的细胞在其中〜70％的细胞表达外源蛋白。在瞬时转染hNSPCs，我们所观察到的〜7天的外源蛋白的持续表达。
Acknowledgements
作者要感谢在儿童医院，奥兰治县提供hNSPC文化研究所的菲利普H ·施瓦茨博士国家人类神经干细胞资源。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
Referências
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
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Citar este artigo
Marchenko, S., Flanagan, L. Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector. J. Vis. Exp. (6), e240, doi:10.3791/240 (2007).