Isolement mitochondriale du muscle squelettique
Summary
Ce protocole décrit une procédure pour étudier la respiration des mitochondries isolées de muscles squelettiques. Cette méthode a été adaptée à partir Scorrano<em> Et al.</em> (2007). La procédure d'isolement des mitochondries nécessite environ 2 heures. La respiration mitochondriale peut être complété en environ 1 heure.
Abstract
Les mitochondries sont des organites le contrôle de la vie et la mort de la cellule. Ils participent à des réactions métaboliques clés, synthétiser plus de l'ATP, et de réglementer un certain nombre de cascades de signalisation 2,3. Les chercheurs actuels et passés ont mitochondries isolées à partir des tissus de rats et de souris, comme le foie, le cerveau et le coeur 4,5. Ces dernières années, de nombreux chercheurs se sont concentrés sur l'étude de la fonction mitochondriale des muscles squelettiques.
Ici, nous décrivons une méthode que nous avons utilisé avec succès pour l'isolement des mitochondries des muscles squelettiques 6. Notre procédure exige que tous les tampons et les réactifs sont frais et ont besoin d'environ 250-500 mg de muscle squelettique. Nous avons étudié les mitochondries isolées de rat et de souris gastrocnémien et le diaphragme et les muscles extraoculaires chez le rat. Concentration de la protéine mitochondriale est mesurée avec le dosage de Bradford. Il est important que les échantillons mitochondriale être conservés glacée pendant la préparation et que des études fonctionnelles être effectuée dans un temps relativement court (~ 1 h). Respiration mitochondriale est mesurée en utilisant la polarographie avec une électrode de type Clark (système oxygraphe) à 37 ° C 7. Calibrage de l'électrode à oxygène est une étape clé dans ce protocole et elle doit être effectuée quotidiennement. Mitochondries isolées (150 ug) sont ajoutés à 0,5 ml de tampon expérimental (EB). Etat 2 la respiration commence avec l'ajout de glutamate (5mm) et malate (2,5 mM). Ensuite, l'adénosine diphosphate (ADP) (150 uM) est ajouté pour commencer l'état 3. Oligomycine (1 pM), un bloqueur synthase ATPase, est utilisé pour estimer l'état 4. Enfin, le cyanure de p-carbonyle [trifluorométhoxy]-phényl-hydrazone (FCCP, 0,2 M) est ajouté à measurestate 5, ou la respiration découplée 6. Le ratio de contrôle respiratoire (RCR), le ratio de l'état 3 à l'état 4, est calculé après chaque expérience. Un RCR ≥ 4 est considéré comme une preuve d'une préparation viables mitochondries.
En résumé, nous présentons une méthode pour l'isolement des mitochondries viables à partir des muscles squelettiques qui peuvent être utilisés dans biochimiques (par exemple une activité enzymatique, immunodétection, protéomique), des études et fonctionnels (respiration mitochondriale).
Protocol
Discussion
Nous présentons un protocole pour isoler les mitochondries viables à partir des muscles squelettiques. Si le rendement est un problème, le protocole peut être modifié en incubant le muscle isolé dans 5 ml de trypsine EDTA/0.01% PBS/10mM pendant 30 minutes dans la glace. Pour assurer la digestion complète du muscle à la trypsine, le muscle doit être pleinement hachée. Après l'incubation de 30 minutes, la solution de trypsine PBS/10mM EDTA/0.01% doit être entièrement remplacé par 3 ml de tampon d'iso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Institut national des yeux (R01 EY12998) à FH Andrade.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
Referências
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
