骨格筋からのミトコンドリア単離
Summary
このプロトコルは、骨格筋から単離したミトコンドリアの呼吸を研究するための手順を説明します。このメソッドは、Scorranoから翻案されました<em>ら。</em>（2007）。ミトコンドリアの単離方法は、約2時間を必要とします。ミトコンドリア呼吸は約1時間で完了することができます。
Abstract
ミトコンドリア細胞の生と死を制御する細胞内小器官です。彼らは、主要な代謝反応に関与ATPの大部分を合成し、カスケード2,3をシグナリングの数を調整する。過去と現在の研究者は、肝臓、脳や心臓4,5としてラットやマウスの組織から単離ミトコンドリアいる。近年、多くの研究者は、骨格筋のミトコンドリア機能の研究に焦点を当てている。
ここで、我々は骨格筋6からミトコンドリアを単離するために正常に使用した方法を説明します。この場合の手続きは、すべてのバッファーと試薬が新鮮作られ、骨格筋の250から500まで約100mgを必要している必要があります。我々は、ラットとマウス腓腹筋と横隔膜から単離したミトコンドリアを研究し、ラットの眼の筋肉。ミトコンドリアタンパク質濃度はBradfordアッセイで測定されます。それは、ミトコンドリアのサンプルが準備中に氷冷状態に保つことと機能に関する研究が比較的短い時間（〜1時間）以内に測定することが重要です。ミトコンドリア呼吸は37クラーク型電極（Oxygraphシステム）° C 7でポーラログラフ分析を用いて測定されます。酸素電極のキャリブレーションは、このプロトコルの重要なステップであり、それを毎日実行する必要があります。単離ミトコンドリア（150μg）を実験的バッファー（EB）の0.5mlに追加されます。状態2呼吸は、グルタミン酸の添加（5mMの）とリンゴ酸（2.5 mM）で始まります。その後、アデノシン二リン酸（ADP）（150μM）は状態3を起動するために追加されます。オリゴマイシン（1μM）、ATPアーゼの酵素ブロッカーは、状態4を推定するために使用されます。最後に、カルボニルシアニドp型[トリフルオロメトキシが] -フェニル-ヒドラゾン（FCCP、0.2μM）は5 measurestateに追加、または呼吸6非結合される。呼吸調節率（RCR）、状態4から状態3の比率は、各実験後に計算されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備の証拠として考えられている。
要約すると、我々は、生化学的（例えば、酵素活性、免疫、プロテオミクス）と機能に関する研究（ミトコンドリア呼吸）で使用することができる骨格筋から実行可能なミトコンドリアの単離のための方法を提示する。
Protocol
Discussion
我々は、骨格筋から実行可能なミトコンドリアを分離するためのプロトコルを提示する。歩留まりに問題がある場合、プロトコルは氷中で30分間PBS/10mM EDTA/0.01％のトリプシン5mlに分離された筋肉をインキュベートすることによって変更することができます。トリプシンとの完全な筋肉の消化を確保するために、筋肉は完全にみじん切りする必要があります。 30分間のインキュベーション後、PB…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立眼研究所（R01 EY12998）からFH Andradeさんへの助成金によって支えられている。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
Referências
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
