Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Atmung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur isoliert zu studieren. Diese Methode wurde von Scorrano angepasst<em> Et al.</em> (2007). Die Mitochondrien isoliert Verfahren erfordert etwa 2 Stunden. Die mitochondriale Atmung kann in ca. 1 Stunde abgeschlossen sein.
Abstract
Mitochondrien sind Organellen Steuerung der Leben und Tod der Zelle. Sie in wichtigen Stoffwechselreaktionen beteiligt, synthetisieren die meisten der ATP, und regeln eine Reihe von Signalkaskaden 2,3. Vergangene und gegenwärtige Forscher haben isolierte Mitochondrien aus Ratten und Mäusen Gewebe wie Leber, Gehirn und Herz 4,5. In den letzten Jahren haben viele Forscher auf die Untersuchung der mitochondrialen Funktion von Skelettmuskeln konzentriert.
Hier beschreiben wir eine Methode, die wir erfolgreich für die Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskeln 6 verwendet. Unser Verfahren erfordert, dass alle Puffer und Reagenzien hergestellt sind frisch und müssen etwa 250-500 mg der Skelettmuskulatur. Wir untersuchten Mitochondrien aus Ratte und Maus gastrocnemius und Zwerchfell isoliert und Ratte Augenmuskeln. Mitochondriale Protein-Konzentration wird mit dem Bradford-Assay gemessen. Es ist wichtig, dass die mitochondriale Proben aufbewahrt eiskalt während der Vorbereitung und funktionelle Studien in relativ kurzer Zeit (~ 1 h) durchgeführt werden kann. Mitochondriale Atmung gemessen mittels Polarographie mit einer Clark-Elektrode (Oxygraph System) bei 37 ° C 7. Die Kalibrierung der Sauerstoffelektrode ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll und muss täglich durchgeführt werden. Isolierte Mitochondrien (150 ug) sind bis 0,5 ml der experimentellen Puffer (EB) aufgenommen. State 2 Atmung beginnt mit Zusatz von Glutamat (5mm) und Malat (2,5 mM). Dann wird Adenosindiphosphat (ADP) (150 nM) zugegeben, um den Zustand 3 zu beginnen. Oligomycin (1 pM), einer ATPase-Synthase-Blocker, wird verwendet, um den Zustand 4 zu schätzen. Schließlich Carbonyl Cyanid p-[Trifluormethoxy]-phenyl-Hydrazon (FCCP, 0,2 uM) wird zugegeben und 5 measurestate oder abgekoppelt Atmung 6. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV), das Verhältnis von Staat 3 bis Zustand 4 wird nach jedem Experiment berechnet. Ein RCR ≥ 4 wird als Beweis für eine tragfähige Mitochondrien Vorbereitung berücksichtigt.
Zusammenfassend stellen wir eine Methode zur Isolierung von lebensfähigen Mitochondrien aus Skelettmuskeln, die in biochemischen (zB Enzymaktivität, Immundetektion, Proteomik) und funktionelle Untersuchungen (mitochondriale Atmung) genutzt werden können.
Protocol
Discussion
Wir präsentieren ein Protokoll, um lebensfähige Mitochondrien aus Skelettmuskulatur zu isolieren. Wenn Ertrag ist ein Problem, kann das Protokoll durch Inkubation der isolierten Muskel in 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% Trypsin für 30 Minuten in Eis verändert werden. Um sicherzustellen, komplette Muskel-Verdau mit Trypsin, muss der Muskel vollständig zerkleinert werden. Nach dem 30-minütigen Inkubation, muss der PBS/10mM EDTA/0.01% Trypsin-Lösung komplett mit 3 ml der Isolation Puffer 1 (IB1) ersetzt werden. Darüber hi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Eye Institute (R01 EY12998) an der FH Andrade unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
Referências
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
