Митохондриальная Изоляция от скелетных мышц
Summary
Этот протокол описывает процедуры для изучения дыхания митохондрии, выделенные из скелетных мышц. Этот метод был заимствован из Scorrano<em> Соавт.</em> (2007). Митохондриальной процедуры изоляции требуется около 2 часов. Митохондриального дыхания может быть завершена в 1 час.
Abstract
Митохондрии являются органеллами управления жизнью и смертью клетки. Они участвуют в основных метаболических реакций, синтезировать большинство из АТФ, и регулировать число сигнальных каскадов 2,3. Прошлые и текущие исследователи выделили митохондрии от крыс и мышей тканей, таких как печень, мозг и сердце 4,5. В последние годы многие исследователи сосредоточились на изучении функции митохондрий из скелетных мышц.
Здесь мы опишем метод, который мы успешно используется для выделения митохондрий из скелетных мышц 6. Наша процедура требует, чтобы все буферы и реагенты производятся свежими и нужно около 250-500 мг скелетных мышц. Мы изучали митохондрии, выделенные из крыс и мышей икроножной мышцы и диафрагма и мышцы крысы экстраокулярных. Митохондриальная концентрации белка измеряется с помощью анализа Брэдфорда. Важно, что митохондриальная образцы хранятся ледяной во время подготовки и функциональных исследований, что быть выполнена в течение относительно короткого времени (~ 1 час). Митохондриальная дыхания измеряется с помощью полярографии с Кларком типа электрода (Oxygraph системы) при температуре 37 ° C 7. Калибровка кислородного электрода является ключевым шагом в этом протоколе, и оно должно быть исполнено в день. Изолированные митохондрии (150 мкг) добавляют к 0,5 мл экспериментальных буфера (ИС). Состояние 2 дыхания начинается с того глутамата (5мм) и малат (2,5 мм). Затем, аденозин дифосфат (АДФ) (150 мкм) добавляется в начальное состояние 3. Олигомицин (1 мкМ), блокатор АТФазы синтазы, используется для оценки состояния 4. Наконец, карбонильные цианида р-[трифторметокси]-фенил-гидразона (FCCP, 0,2 мкМ) добавляется к measurestate 5, или несвязанных дыхания 6. Дыхательный коэффициент (РКП), отношение государственного 3 до состояния 4, рассчитывается после каждого эксперимента. RCR ≥ 4 рассматривается как свидетельство жизнеспособных митохондрий подготовки.
Таким образом, мы представляем метод выделения жизнеспособных митохондрий скелетных мышц, которые можно использовать в биохимических (например, активность ферментов, иммунодетекции, протеомика) и функциональные исследования (митохондриального дыхания).
Protocol
Discussion
Мы представляем протокол, чтобы изолировать жизнеспособных митохондрий скелетных мышц. Если выход проблему, протокол может быть изменен путем инкубации изолированной мышцы в 5 мл PBS/10mM EDTA/0.01% трипсина в течение 30 минут во льду. Для обеспечения полного переваривания мышц трипсином, мышц?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института глаза (R01 EY12998) до FH Андраде.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
Referências
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
