Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere
Summary
Questo protocollo video mostra l'applicazione del test neurosfere per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali da eminenze gangliari del giorno embrionale 14-topo cervello.
Abstract
In mammiferi, le cellule staminali agisce come una fonte di cellule indifferenziate per mantenere la genesi e il rinnovamento cellulare in vari tessuti ed organi durante la vita dell'animale. Essi possono potenzialmente sostituire le cellule che si perdono nel processo di invecchiamento o in via di infortuni e malattie. L'esistenza di cellule staminali neurali (NSC) è stato descritto da Reynolds e Weiss (1992) negli adulti dei mammiferi sistema nervoso centrale (SNC) utilizzando un siero privo di sistema di coltura romanzo, il saggio neurosfere (NSA). Da questo test, è anche possibile isolare ed espandere NSCs provenienti da diverse regioni del SNC embrionale. Queste NSCs espanse in vitro sono multipotenti e possono dar luogo a tre tipi principali di cellule del sistema nervoso centrale. Mentre la NSA sembra relativamente semplice da eseguire, l'attenzione alle procedure dimostrato qui è necessario per ottenere risultati affidabili e coerenti. Questo video dimostra praticamente NSA per generare ed espandere NSCs fin dal primo giorno embrionale 14-topo tessuto cerebrale e fornisce dettagli tecnici così si può raggiungere culture neurosfere riproducibile. La procedura prevede la raccolta E14 embrioni di topo, microdissezione cervello per raccogliere le eminenze gangliari, dissociazione dei tessuti raccolti in NSC medio per ottenere una sospensione singola cellula e, infine, placcatura cellule in coltura NSA. Dopo 5-7 giorni di cultura, la risultante neurosfere primarie sono diversi passaggi di espandere ulteriormente il numero delle NSCs per gli esperimenti futuri.
Protocol
Discussion
Il dosaggio neurosfere è il metodo di scelta per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali 1-5 per la sua semplicità e riproducibilità. Questo saggio è uno strumento prezioso per la grande generazione di cellule precursori indifferenziati sistema nervoso centrale, che potrebbe essere utilizzato sia per in vitro e in vivo. Va sottolineato che neurosfere potrebbe essere generato sia dalla bona fide cellule staminali e progenitori neurali più ristretto. Pertanto, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Overstreet.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
Referências
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
