Summary

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

Published: January 11, 2011
doi:

Summary

Este protocolo de vídeo se muestra la aplicación de la prueba neuroesfera para el aislamiento y la expansión de las células madre neurales de las eminencias ganglionares del día embrionario 14 de cerebro de ratón.

Abstract

En los mamíferos, las células madre actúa como una fuente de células indiferenciadas para mantener génesis y renovación celular en diferentes tejidos y órganos durante el ciclo de vida del animal. Que potencialmente pueden reemplazar las células que se pierden en el proceso de envejecimiento o en el proceso de lesiones y enfermedades. La existencia de células madre neurales (NSC) fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss (1992) en los mamíferos adultos del sistema nervioso central (SNC) utilizando un nuevo sistema de suero libre de la cultura, el ensayo neuroesfera (NSA). El uso de este ensayo, también es posible aislar y expandir NSCs de diferentes regiones del sistema nervioso central embrionario. Estos in vitro NSCs ampliado son multipotentes y pueden dar lugar a los tres principales tipos de células del sistema nervioso central. Mientras que la NSA parece relativamente simple de realizar, la atención a los procedimientos demostrado aquí se requiere a fin de lograr resultados confiables y consistentes. Este video demuestra prácticamente la NSA para generar y ampliar NSCs a partir del día 14 embrionario del ratón tejido cerebral y ofrece detalles técnicos por lo que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la recolección de embriones de ratón E14, microdisección del cerebro para recoger las eminencias ganglionares, la disociación de los tejidos recolectados en el medio de NSC para obtener una suspensión de células individuales, y, finalmente, placas células en cultivo NSA. Después de 5-7 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes se pasan a ampliar aún más el número de la NSCs para futuros experimentos.

Protocol

1. Configuración básica antes de proceder a la disección: Volumen apropiado de medio completo NSC se prepara mezclando NeuroCult NSC medio basal y NeuroCult Suplementos NSC proliferación en una proporción de 9:1, respectivamente. El medio es calentado en un baño de agua a 37 ° C. Frío HEPES buffer medio esencial mínimo (HEM), con alta concentración de antibióticos (10%) se prepara para la disección y el propósito de lavado. Por otra parte, NSC medio basal con la suplementació…

Discussion

El ensayo neuroesfera es el método de elección para el aislamiento y la expansión de las células madre neurales 1-5 debido a su sencillez y reproducibilidad. Este ensayo es una herramienta invaluable para generación a gran escala de células precursoras indiferenciadas del SNC, que podrían ser utilizados para los estudios in vitro e de vivo. Cabe destacar que neuroesferas podrían ser generados por la bona fide las células madre neuronales y progenitores más restringido. Por…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
NeuroCult NSC Basal Medium Medium Stem Cell Technologies 05700  
NeuroCult NSC Proliferation Supplements Medium supplement Stem Cell Technologies 05701  
%0.05 trypsin-EDTA Reagent Gibco 25300-062  
Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma T6522  
Pen/Strep Reagent Gibco 15140-122  
*MEM Reagent Gibco 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma H4034 HEM component
*Distilled water Reagent Gibco 15230-147  
Cell strainer Sieve BD Falcon 352340  
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196  
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905  
15 ml tubes Culture ware BD Falcon 352096  
50 ml tubes Culture ware BD Falcon 352070  
Fine curved forceps Surgical tools Fine Science Tools 11251‐35  
Small fine forceps Surgical tools Fine Science Tools 11272‐30  
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050‐10  
Fine scissors Surgical tools World Percision Instruments, Inc. 500216  
EGF Growth factor R&D 2028-EG  
b-FGF Growth factor R&D 3139-FB  
Heparin Growth factor Sigma H4784 Reconstituted in PBS

*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.

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Citar este artigo
Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457, doi:10.3791/2457 (2011).

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