Etablera Embryonala Mus Neurala Kultur Stem Cell Använda Neurosphere analys
Summary
Denna video protokoll visar tillämpningen av neurosphere test för isolering och utbyggnad av neurala stamceller från ganglieblockerande eminens embryonala dag 14-musen hjärnan.
Abstract
I mammalians fungerar stamceller som en källa till odifferentierade celler för att upprätthålla cellens uppkomst och förnyelse i olika vävnader och organ under den livslängd djuret. De kan potentiellt ersätta celler som går förlorade i åldrandeprocessen eller i färd med att skada och sjukdom. Förekomsten av neurala stamceller (NSCs) beskrevs först av Reynolds och Weiss (1992) i den vuxna däggdjur centrala nervsystemet (CNS) enligt en ny serumfritt kultur system, neurosphere analys (NSA). Med hjälp av denna analys är det också möjligt att isolera och expandera NSCs från olika regioner av embryonala CNS. Dessa in vitro expanderade NSCs är multipotenta och kan ge upphov till de tre stora celltyper i CNS. Medan NSA verkar relativt enkla att utföra, uppmärksamma de förfaranden som visats här krävs för att erhålla tillförlitliga och konsekventa resultat. Denna video demonstrerar praktiskt NSA för att skapa och expandera NSCs från embryonala dag 14-musen hjärnvävnad och ger tekniska detaljer så kan man uppnå reproducerbara neurosphere kulturer. Förfarandet omfattar skörd E14 musembryon, hjärnan microdissection att skörda ganglieblockerande höjder, dissociation av den skördade vävnad i NSC mediet för att få en enda cell fjädring och slutligen plätering celler i NSA kultur. Efter 5-7 dagar i kultur, är den resulterande primära neurospheres passerats att ytterligare utöka antalet NSCs för framtida experiment.
Protocol
Discussion
Den neurosphere analysen är den metod som föredras för isolering och expansion av neurala stamceller 1-5 grund av dess enkelhet och reproducerbarhet. Denna analysmetod är ett ovärderligt verktyg för storskalig produktion av odifferentierade CNS föregångare celler, som kan användas för både in vitro och in vivo-studier. Det bör understrykas att neurospheres kan genereras från både seriösa neurala stamceller och mer begränsad stamceller. Därför beräkna neurosphere bildar oft…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av medel från Overstreet Foundation.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Percision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
Referências
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. e. y. n. o. l. d. s. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
