Summary
C57BL 6 / चूहों कोर्ट रोगजनन अध्ययन के लिए और सबसे अच्छा मॉडल प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम इस कवक के खिलाफ humoral रोगक्षमता के संभावित लाभ की खोज कर रहे हैं और [histone H2B और एक गर्मी झटका प्रोटीन 60kDa] कई Mabs उत्पन्न कि हम intraperitoneal प्रशासन के बाद उनके सुरक्षा प्रभावकारिता के लिए परीक्षण किया गया.
Protocol
1. एच. की वृद्धि Capsulatum
- कवक के साथ काम करने के लिए 10% ब्लीच 20 मिनट यूवी विकिरण के द्वारा पीछा के साथ कैबिनेट सफाई से एक जैव सुरक्षा कैबिनेट एच. तैयार. खमीर चरण में capsulatum जैवसुरक्षा स्तर (BSL) द्वितीय प्रथाओं की आवश्यकता है, जबकि मोल्ड फार्म BSLIII की आवश्यकता है. निम्नलिखित चरणों में खमीर फार्म का उपयोग करें.
- अगले पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार करते हैं. एच. की एक कॉलोनी हार्वेस्ट एक भी रक्त अगर [ग्लूकोज 10 जी / एल, सिस्टीन 0.1 छ / एल, पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन 50% 1 और भेड़ लाल रक्त कोशिकाओं / एमएल एल (संयुक्त राज्य अमेरिका कोलोराडो सीरम कं, कोलोराडो,) थाली से capsulatum (तनाव कोर्ट ATCC G217B) ] 37 डिग्री सेल्सियस पर खेती या -80 ° C पर जमी खमीर स्टॉक से विभाज्य ले और यह पीबीएस को जोड़ने. कोशिकाओं को सख्ती से भंवर और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1100 XG के लिए अपकेंद्रित्र. ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटाने और ताजा पीबीएस के 10ml जोड़ें. इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएँ. पीबीएस और tranfer की एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब 5ml में कोशिकाओं को निलंबित.
- एकत्रित कोशिकाओं को बाधित करने के लिए, एक 26 G1 / 2 सुई यू के माध्यम से खमीर कोशिका निलंबन पास एक 10ml सिरिंज एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (चेहरे की सुरक्षा का उपयोग करके ) में 5 बार गाते हैं. छोटे, समान आकार के खमीर को अलग करने के लिए, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 55 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और फिर शीर्ष 1 मिलीलीटर हटायें.
- एक बाँझ erlenmeyer फ्लास्क हैम F12 माध्यम के 100 मिलीलीटर (GIBCO) 16g / एल ग्लूकोज, / 1g एल glutamic एसिड, 8.4mg / एल cystine, 6g / एल glutamic एसिड और फिर 37 पर कोशिकाओं के विकास के साथ पूरक युक्त सेल निलंबन जोड़ें ° सी 150rpm झटकों के साथ 48 घंटे एक इनक्यूबेटर में के लिए.
2. हाइब्रिडोमा और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के विकास और शोधन
- DMEM मध्यम युक्त 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 10% NCTC, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड और 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन चयनित hybridomas स्थानांतरण. एक सेल संस्कृति फ्लास्क (Becton Dickenson) में कोशिकाओं के 5-7 दिनों के लिए 37 पर आगे बढ़ें ° सी / 5% सीओ 2.
- फिर 1100 XG पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मध्यम और अपकेंद्रित्र छर्रों में बाधा पहुँचा के बिना सभी सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
- अगले, सेल मुक्त FPLC द्वारा ए / जी राल एक प्रोटीन का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला शुद्ध.
- MAB एकाग्रता तो एक पर कब्जा (1) एलिसा मानक के रूप में एक आईजीजी निर्धारण नियंत्रण (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता है.
3. Histoplasma Capsulatum Inoculum तैयारी
- एक 48 घंटे Histoplasma capsulatum (तनाव कोर्ट ATCC G217B) खमीर चरण हैम मध्यम F-12 में विकसित संस्कृति लो.
- 10 मिनट के लिए 1100 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा पीबीएस जोड़ने.
- 3.2 प्रक्रिया 3 बार दोहराएँ.
- खमीर कोशिका निलंबन एक 26G1 / 2 एक सिरिंज का उपयोग कर सुई के माध्यम से 5 बार गुजरती हैं.
- 1 मिनट के लिए गोली अवशिष्ट सेल समूहों को 55 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र. स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला एक नया ट्यूब के लिए एकल कक्ष निलंबन युक्त.
- एकल कक्ष एक hematocytometer का उपयोग निलंबन की गणना करें.
- सेल एकाग्रता समायोजित क्रम में 1.25 x 10 7 (अस्तित्व) खमीर या 5.0 x 10 6 (CFU, साइटोकिन्स और ऊतक विज्ञान) <50 μL (चित्रा 2) के एक suspention में प्राप्त करने के.
4. Mabs के Intraperitoneal प्रशासन
- अपनी पूंछ और गर्दन के कूड़ा (चित्र 3A) द्वारा माउस उठाओ. संभव के रूप में theears (चित्रा 3B और 3C यकीन है कि पर्याप्त त्वचा ले ताकि माउस उसके सिर cannotturn करने के लिए इसे संभाल व्यक्ति काटने) के करीब के रूप में अपनी गर्दन के कूड़ा द्वारा माउस स्थिर.
- स्थिर पूंछ withthe थोड़ा उंगली धीरे से हाथ की हथेली (चित्रा 3 डी) के खिलाफ दबाया.
- 70% इथेनॉल के साथ सुई और करने के लिए इंजेक्शन लगाने से पहले रक्त के लिए देखो aspirate रखने से पहले इंजेक्शन क्षेत्र झाड़ू से साफ़ करना.
- MAB thelower छोड़ दिया है या कम सही पेट वृत्त का चतुर्थ भाग (intraperitoneal गुहा) में 500μg (Pbs, निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी या MAB के लिए परीक्षण किया है, 1 एमएल पीबीएस में पतला) युक्त समाधान के साथ, इंजेक्षन करने के लिए त्वचा और abdominalmuscles piercethe 26G1 / 2 का प्रयोग करें स्थिति नीचे सिर में पशु, देखभाल लेने के लिए डायाफ्राम andother आंतरिक अंगों (3E चित्रा) से बचने के.
- संक्षेप में वापस लेने needleto रिसाव की संभावना को कम करने से पहले रुको.
- अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले दो घंटे की एक न्यूनतम रुको.
5. माउस संज्ञाहरण और intranasal संक्रमण
- 100 मिलीग्राम / किलोग्राम और 10 मिलीग्राम / किलोग्राम क्रमशः, ketamine और xylazine का उपयोग संज्ञाहरण तैयार. पीबीएस की intraperitoneal प्रशासन निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी, या प्रयोगात्मक एंटीबॉडी के साथ लिखा प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में प्रदर्शन. MAB इंजेक्शन के बाद दो घंटे माउस anesthetizing और intranasal संक्रमण के साथ आगे बढ़ने से पहले रुको.
100 मिलीग्राम / किलोग्राम और 10 मिलीग्राम / किलोग्राम क्रमश: (7) संज्ञाहरण का उपयोग ketamine और xylazine तैयार करें. - 2 प्रतीक्षा अवधि के दौरान, Histoplasma capsulum inoculum साथ लिखा प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तैयार.
- 5,5 करने के लिए 5,1 itens के अनुसार आगे बढ़ें. एक चिमटी से नोचना के साथ जानवरों चुटकी पैर की अंगुली और पलटा की अनुपस्थिति को सत्यापित करने और पुष्टि करते हैं कि संज्ञाहरण काम anaesthetization के बाद, धीरे से उसके सामने दांत के द्वारा एक नायलॉन या कपास स्ट्रिंग के लिए माउस को निलंबित.. 2 स्तंभ खड़ा का उपयोग करने के लिए तार टाई क्रम में पशुओं को निलंबित करने के लिए.
- धीरे धीरे एक रखना एक micropipette का उपयोग जबकि निकट माउस श्वसन दर की निगरानी में लगभग 50 μl inoculum प्रशासन. माउस इस स्थिति में intranasal संक्रमण के बाद 2-5 मिनट के लिए आराम करने के लिए जानवर के फेफड़ों (3F चित्रा) में खमीर के बयान की सुविधा दें.
- बाद माउस संक्रमित कर दिया गया है, एक निगरानी, गर्म वातावरण (25 और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान) में माउस को बनाए रखने के लिए, ध्यान से एक गर्मी दीपक का उपयोग यदि आवश्यक हो, जब तक यह संज्ञाहरण से ठीक है. जब माउस जागता है, यह विज्ञापन libitum भोजन और पानी के लिए उपयोग के साथ एक साफ पिंजरे वापस पिंजरों हमारे जानवरों की सुविधा के लिए लौट रहे हैं और एक साफ जानवर कमरा (BLSI) में रखा है. .
6. जीवन रक्षा अध्ययन
- संक्रमित और नकली संक्रमित पशुओं को चिकित्सकीय आकलन tachypnea, सुस्ती, obtundation, और वजन घटाने के लिए. जानवरों की प्रयोगशाला के सदस्यों और पशु caretakers द्वारा दैनिक द्वारा दो बार दैनिक जाँच की जानी चाहिए.
- Murine histoplasmosis के साथ, जीवन के अंत के करीब तक, वहाँ आम तौर पर कर रहे हैं श्वसन की दर में एक मामूली वृद्धि के अलावा अन्य संक्रमण का कोई स्पष्ट संकेत है. उन्नत रोग है, जो आमतौर पर 10-11 दिनों से होता है के साथ चूहों काफी tachypneic हो जाते हैं और कम गतिविधि है. आमतौर पर वे तेजी से मरणासन्न हो जाते हैं और समय सीमा समाप्त हो.
- परेशान पशुओं के एक समर्पित कक्ष में सीओ 2 के साथ उचित euthanized चाहिए, मृतक पशुओं दैनिक प्रगणित होना चाहिए.
7. CFU अध्ययन, प्रोटोकॉल, और साइटोकिन्स अध्ययन
- 10ml पीबीएस के साथ प्रत्येक अंग के लिए एकत्र हो 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों तैयार करें.
- Sublethal inuculum (5.0 6 x 10) के रूप में पहले दिखाया गया के साथ 7 जानवरों और संक्रमण के बाद 14 दिनों euthanize और फेफड़ों, तिल्ली, और जिगर को तुरंत हटाने.
- मूल्यांकन किया जाना अंग का एक टुकड़ा निकालें और formalin रात में नियतन प्रदर्शन. वर्गों रोग के मूल्यांकन के लिए माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जाएगी.
- 5ml पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों तैयार प्रत्येक अंग homogenized हो के लिए 70 सुक्ष्ममापी सेल strainers के साथ अव्वल रहा. अंगों में से प्रत्येक के शेष भाग को अलग से 50 एमएल बाँझ 5ml सिरिंज plungers का उपयोग ट्यूबों में सिझाना.
- अगला, अंग serially (1:100, 1:1000 और 1:5000) और भी रक्त अगर प्लेटें (2) पर homogenates प्रत्येक कमजोर पड़ने की थाली 100μL पतला.
- Homogenates protease अवरोध करनेवाला गोलियाँ निर्माण के निर्देशों (Roche, जर्मनी) के अनुसार जोड़ें.
- 37 में प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस के लिए 14 दिन और एन्यूमरेट करने CFUs.
- 4000xg अंग homogenates और 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र अंग supernatants हटायें, whish cytokine निर्माता के अनुसार मानक विधियों द्वारा किया assays में इस्तेमाल में इस्तेमाल किया जाएगा.
8. एच. के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी संरक्षण Capsulatum एंटीबॉडी विशिष्टता और निर्धारण पर निर्भर है
- MAB निर्धारण एच. के खिलाफ संरक्षण में महत्वपूर्ण है capsulatum IgG1 या IgG2a Mabs साथ Hsp60 इलाज चूहों के रूप में काफी लंबे समय तक Hsp60 के लिए एक IgG2b MAB प्राप्त चूहों या तो एक निर्धारण नियंत्रण एमएबी या पीबीएस (चित्रा 4) के नियंत्रण की तुलना में अस्तित्व है.
- इसके अलावा, चूहों कि सुरक्षा Mabs प्राप्त में, वहाँ फेफड़े और प्लीहा - संबंधी CFU की संख्या में 7 दिन में एक महत्वपूर्ण कमी थी और 14 दिन (चित्रा 5) में फेफड़ों में खमीर संख्या के 2 और 2.5 लॉग इन इकाइयों के कम हो जाती है.
चित्रा 1: एच. का विकास capsulatum और hybridomas. (ए) एक एकल एच. से प्राप्त कॉलोनी से तरल हैम F-12 संस्कृति तैयारी capsulatum एक भी रक्त अगर प्लेटों पर हो. (बी) सेल संस्कृति बोतल और एक / जी राल का उपयोग आत्मीयता cromatography प्रोटीन द्वारा MAB शुद्धि में हाइब्रिडोमा विकास.
चित्रा 2: एच. capsulatum intranasal संक्रमण के लिए inoculum तैयारी . सेल एच. के बाद प्राप्त निलंबन सिरिंज और centrifugation द्वारा capsulatum समुच्चय व्यवधान hemocytometer में गिनती द्वारा enumerated है. सेल एकाग्रता 1.25 के लिए निकाला जाता है x 10 (अस्तित्व प्रयोगों) 7 या 5 x 10 <50 μL में 6 (CFUs, साइटोकिन्स और ऊतक विज्ञान).
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चित्रा 3: MAB प्रशासन के दौरान माउस हैंडलिंग. (ए) माउस पूंछ से उठाया है और (ख और ग) अपनी गर्दन के झोंटा पकड़ के रूप में theears के लिए बंद द्वारा immobilized. (डी) पूंछ छोटी उंगली और हथेली के बीच आयोजित किया जाता है. (ई) MAB समाधान एक सुई 26G1 / 2 का उपयोग करने के लिए अंतःक्षिप्त है. (एफ) एच. capsulatum inoculum intranasally धीरे n क्या में सेल निलंबन pipetting द्वारा प्रशासित किया जाता है.
चित्रा 4: Hsp60 के लिए Mabs histoplasmosis के रोगजनन में परिवर्तन कर सकते हैं. μg IgG1 के 500, या IgG2a Mabs 2 संक्रमण काफी लंबे समय तक अस्तित्व (पी <नियंत्रण की तुलना में 0.05,) के लिए पहले घंटे, लेकिन एक IgG2b MAB के साथ आईपी इंजेक्शन.
चित्रा 5: 7 बजे CFU फेफड़ों में determinations और 5x10 6 चूहों के कोर्ट Hsp60 चयनित Mabs या अप्रासंगिक MAB IgG1 और IgG2a के लिए कवक बोझ में कमी देखी गई Mabs पशुओं का इलाज के साथ इलाज आईपी yeasts के साथ एक sublethal intranasal चुनौती के बाद 14 दिनों . काले सलाखों के दिन 7 पर CFUs और सफेद सलाखों प्रतिनिधित्व करते हैं और 14 दिनों के बाद संक्रमण (* पी <7 दिनों में 0.001 और ** 14 दिनों के बाद संक्रमण पर 0.001 <पी).
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि MAB एच. करने के लिए capsulatum प्रयोगात्मक murine histoplasmosis के पाठ्यक्रम को संशोधित कर सकते हैं . सेल रोगजनकों के सतह प्रतिजनों Mabs जटिल गतिशीलता है कि एक मेजबान और एक रोगज़नक़ के बीच परस्पर क्रिया के दौरान होने संशोधित कर सकते हैं. इस अध्ययन से यह स्थापित किया है कि Mabs घातक histoplasmosis के एक murine मॉडल में सुरक्षा मध्यस्थता जब intraperitoneally इंजेक्शन, और यह टीका विकास के लिए उम्मीदवार H2B, एम प्रतिजन (catalase सतह) (3) और Hsp60 के रूप में, प्रोटीन पता चलता है. Vivo में, कोर्ट Hsp60 और H2B सुरक्षा Mabs की प्रशासन अंग कवक बोझ और सूजन और संक्रमित चूहों के लंबे समय तक अस्तित्व कम.
हालांकि एच. के लिए टीका विकास capsulatum अनुसंधान के एक रोमांचक क्षेत्र है, टीकाकरण immunocompromised व्यक्तियों में प्रभावी नहीं हो सकता है, क्योंकि वे जरूरी एक immunoresponse नहीं आर्केस्ट्रा कर सकते हैं हो सकता है. इसलिए, यह स्पष्ट है कि इस आबादी ज्यादातर एच. MAB के साथ निष्क्रिय चिकित्सा से लाभ हो सकता है capsulatum प्रतिजनों. हमारे आंकड़े बताते हैं कि विशेष रूप से Hsp60 या अन्य Mabs के साथ संयोजन में कोशिका की सतह प्रतिजनों Mabs, histoplasmosis (4, 6) के साथ रोगियों के उपचार में सुधार सकता है. इसके अतिरिक्त, एक एमएबी एच. संयोजन रोधी दवा चिकित्सा के साथ capsulatum synergistic और रक्षात्मक क्षमता में और अधिक प्रभावी किया जा सकता है. Amphotericin बी पसंद की दवा है और आमतौर पर histoplasmosis के प्रारंभिक उपचार के लिए इस्तेमाल किया. इसलिए, MAB रोधी दवा चिकित्सा के अलावा भविष्य के अध्ययन में माना जाना चाहिए. वास्तव में, हम पहले H2B और हमारे पशु मॉडल (5) में उप निरोधात्मक amphotericin बी की सांद्रता Mabs की एक synergistic प्रभाव का प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, Mabs histoplasmosis के प्रकोप में prophylactically प्रशासित सकता है विशेष रूप से मानव इम्यूनो वायरस संक्रमण या TNF-α inhibitors प्राप्त रोगियों के साथ व्यक्तियों के रूप में में उच्च जोखिम वाले व्यक्तियों,. सुरक्षात्मक MAB का भविष्य जांच histoplasmosis और एच. के खिलाफ एंटीबॉडी समारोह के रोगजनन में अतिरिक्त महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रकट कर सकते हैं capsulatum और, शायद, अन्य intracellular रोगज़नक़ों.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
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