שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים
Summary
שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.
Abstract
הדמיה היא טכניקה ערך שיכולים לשמש כדי לפקח על תהליכים ביולוגיים. בפרט, נוכחות של תאים סרטניים, בתאי גזע, סוגי תאים חיסוניים ספציפיים, פתוגנים נגיפיים, טפילים וחיידקים ניתן בעקבות בזמן אמת תוך חיים בעלי חיים 1-2. יישום של הדמיה פליטת אור ללימוד פתוגנים יש יתרונות לעומת אסטרטגיות לניתוח קונבנציונלי של זיהומים במודלים של בעלי חיים 3-4. זיהומים ניתן דמיינו בתוך חיות אדם לאורך זמן, ללא צורך המתת חסד כדי לקבוע את המיקום והכמות של הפתוגן. הדמיה אופטית המאפשרת בחינה מקיפה של כל רקמות ואיברים, ולא דגימה של אתרים ידועים בעבר להיות נגועים. בנוסף, הדיוק של חיסון לתוך רקמות ספציפיות ניתן לקבוע ישירות לפני ביצוע חיות קדימה שהיו מחוסן הצלחה לאורך הניסוי כולו. השוני בין בעלי החיים יכול להיות נשלט, מאחר הדמיה מאפשר לכל בעל חיים אחר להיות בנפרד. הדמיה יש פוטנציאל לצמצם במידה ניכרת את מספר בעלי החיים הדרושים בגלל היכולת לקבל נתונים מנקודות זמן רב מבלי מדגם רקמות כדי לקבוע 3-4 לטעון הפתוגן.
פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמיין זיהומים בבעלי חיים באמצעות דימות של פליטת אור רקומביננטי זנים של חיידקים להביע בלוציפראז. החיפושית לחץ (CBRLuc) ו luciferases גחלילית (FFluc) לנצל luciferin כמו מצע 5-6. האור המיוצר על ידי שתי CBRluc ו FFluc יש אורך גל רחב של nm 500-700 ננומטר, מה שהופך את אלה luciferases כתבים מעולה עבור דימות אופטי במודלים של בעלי חיים החיים 7-9. זה בעיקר בגלל אורכי הגל של האור יותר מאשר 600 ננומטר נדרשים כדי למנוע ספיגה של המוגלובין, ולכן עוברים דרך רקמות יונקים ביעילות. בלוציפראז הוא הציג גנטית לתוך חיידקים כדי לייצר אות אור 10. עכברים הם ריאתי מחוסן עם חיידקים bioluminescent intratracheally לאפשר ניטור של זיהומים בזמן אמת. לאחר הזרקת luciferin, תמונות נרכשים באמצעות מערכת דימות IVIS. במהלך הדמיה, עכברים מורדמים עם isoflurane באמצעות XGI-8 מערכת Anethesia גז. דמויות יכולות להיות מנותח למקם ולכמת את מקור האות, המייצגת את אתר זיהום חיידקי (ים) ומספר, בהתאמה. לאחר הדמיה, נחישות CFU מתבצעת על רקמת הומוגני כדי לאשר את קיומו של החיידק. כמה מנות של חיידקים המשמשים לקשר בין מספרי חיידקים עם הארה. הדמיה ניתן ליישם מחקר של הפתוגנזה והערכה של יעילות של תרכובות וחיסונים אנטיבקטריאלי.
Protocol
Discussion
למרות הבאים הפרוטוקולים הללו יהיו בדרך כלל תוצאה של תמונות באיכות גבוהה, חשוב לשקול כמה נושאים מרכזיים על מנת לקבל נתונים מדויקים ועקביים של לימודי הדמיה. תמונות הארה יש רכשה כי יש ספירת 600 מתוך 60,000 כדי להבטיח כי האות מעל הרקע ואת המצלמה לא רווי. אם האות המתקבל הוא פחו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים מעבדה חברי צ'ירילו לדיונים בעלי ערך וסיוע לאורך כל תקופת המחקר הזה. אנו מודים לד"ר יהושע היל המעבדה של ד"ר ג'יימס סמואל לקבלת סיוע במהלך הסרטה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק של 48,523 ביל ומלינדה גייטס ולהעניק AI47866 מן המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isoflurane | VETONE | 501027 | ||
| Ketamine | Butler animal health supply | |||
| Xylazine | MP Biomedical | 158307 | ||
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | ||
| Fetal plus solution | VOR tech pharmaceutical | |||
| Cathether (22G x 1”) | TERUMO | OX2225CA | ||
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | ||
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | ||
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | |||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | |||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | |||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | |||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
Referências
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
- Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
- Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
- Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).
