Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos
Summary
Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.
Abstract
Imagem é uma técnica valiosa que pode ser usado para monitorar processos biológicos. Em particular, a presença de células cancerosas, células-tronco, tipos específicos de célula imunológica, patógenos virais, parasitas e bactérias podem ser acompanhadas em tempo real dentro de animais vivos 1-2. Aplicação de imagem de bioluminescência para o estudo de patógenos tem vantagens em relação às estratégias convencionais para análise de infecções em modelos animais 3-4. Infecções podem ser visualizados dentro de animais individuais ao longo do tempo, sem a necessidade de eutanásia para determinar a localização ea quantidade do patógeno. Imageamento óptico permite o exame abrangente de todos os tecidos e órgãos, ao invés de amostragem de locais previamente conhecido por ser infectados. Além disso, a precisão da inoculação em tecidos específicos pode ser diretamente determinada antes do transporte de animais para a frente que foram inoculados sem sucesso durante todo o experimento. Variabilidade entre os animais podem ser controlados pela falta de imagens permite que cada animal a ser seguido individualmente. Imagem tem o potencial para reduzir significativamente o número de animais necessários por causa da capacidade de obter dados de numerosos pontos de tempo sem a necessidade de tecidos de amostra para determinar carga de patógenos 3-4.
Este protocolo descreve métodos para visualizar infecções em animais vivos usando imagens de bioluminescência de linhagens recombinantes de bactérias expressando luciferase. O besouro clique (CBRLuc) e luciferases firefly (FFluc) utilizam como substrato luciferina 5-6. A luz produzida por ambos os CBRluc FFluc e tem um comprimento de onda de 500 nm larga a 700 nm, tornando estes luciferases repórteres excelente para a imagem óptica em modelos animais de vida 7-9. Isso ocorre principalmente porque comprimentos de onda da luz é superior a 600 nm são necessárias para evitar a absorção pela hemoglobina e, assim, viajar através de tecidos de mamíferos, de forma eficiente. Luciferase é geneticamente introduzido na bactéria para produzir sinal de luz 10. Os ratos são pulmonar inoculada com bactérias bioluminescentes intratraqueal para permitir o monitoramento de infecções em tempo real. Após a injeção luciferina, as imagens são adquiridas usando o Sistema de Imagem IVIS. Durante a gravação, os ratos são anestesiados com isoflurano usando uma XGI-8 Gas Sistema Anethesia. As imagens podem ser analisados para localizar e quantificar a fonte do sinal, que representa o local da infecção bacteriana (s) e número, respectivamente. Depois de imagem, a determinação de UFC é realizada em tecido homogeneizado para confirmar a presença de bactérias. Várias doses de bactérias são usadas para correlacionar número de bactérias com luminescência. Imagem pode ser aplicada ao estudo da patogenia e avaliação da eficácia dos compostos antibacterianos e vacinas.
Protocol
Discussion
Apesar de seguir estes protocolos normalmente irá resultar em imagens de alta qualidade, é importante considerar algumas questões-chave a fim de obter dados precisos e consistentes a partir de estudos de imagem. Luminescência imagens devem ser adquiridas que têm contagens de 600 a 60000 para garantir que o sinal está acima do fundo ea câmera não está saturado. Se o sinal obtido é inferior a 600 as condições de exposição deve ser ajustado para aumentar a contagem. Se o sinal obtido é mais de 60.000 a câme…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem os membros Cirillo laboratório pelas valiosas discussões e assistência ao longo deste estudo. Agradecemos ao Dr. Joshua Hill e do laboratório do Dr. James Samuel para a assistência durante as filmagens com o do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por bolsa 48523 da Fundação Bill & Melinda Gates Foundation e AI47866 concessão do National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isoflurane | VETONE | 501027 | ||
| Ketamine | Butler animal health supply | |||
| Xylazine | MP Biomedical | 158307 | ||
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | ||
| Fetal plus solution | VOR tech pharmaceutical | |||
| Cathether (22G x 1”) | TERUMO | OX2225CA | ||
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | ||
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | ||
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | |||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | |||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | |||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | |||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
Referências
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
- Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
- Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
- Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).
