Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie
Summary
Wir stellen Ihnen eine ganze-mount Immunhistochemie und konfokaler mit mehreren Kennzeichnung für die Analyse von komplizierten Gefäßnetz Bildung in embryonalen Maus Gliedmaßen Haut.
Abstract
Whole-mount immunhistochemische Analyse zur Abbildung des gesamten Gefäßsystem ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der zellulären Mechanismen der Verzweigung Morphogenese. Wir haben das Bein Haut Gefäßsystem Modell der vaskulären Entwicklung, in der eine bereits bestehende primitive Kapillarplexus in eine hierarchisch verzweigten Gefäßnetz reorganisiert wird Studie entwickelt. Whole-mount konfokalen Mikroskopie mit mehreren Kennzeichnung ermöglicht robuste Bildgebung von intakten Blutgefäßen sowie deren zelluläre Komponenten, einschließlich Endothelzellen, Perizyten und glatte Muskelzellen, mit spezifischen fluoreszierenden Marker. Advances in diesem Teil der Haut Gefäßsystem Modell mit genetischen Studien haben ein besseres Verständnis molekularer Mechanismen der vaskulären Entwicklung und Strukturierung. Das Glied Haut Gefäßsystem Modell wurde verwendet, zu untersuchen, wie peripheren Nerven eine räumliche Vorlage liefern für die Differenzierung und Strukturierung von Arterien. Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache und robuste Protokoll zu intakten Blutgefäßen mit vaskulären spezifische Antikörper und fluoreszierende Sekundärantikörper werden, die für vaskularisierte embryonale Organe, wo wir in der Lage sind, den Prozess der vaskulären Entwicklung folgen Fleck.
Protocol
Discussion
Das Gefäßsystem ist entscheidend für die Entwicklung der Organe während der Embryonalentwicklung sowie für Orgel Wartung und reproduktiven Funktionen in die Erwachsenen, weil es genügend Sauerstoff und Nährstoffe zu den Organen liefert. Proper Gefäßnetz ist mit komplexen und mehrstufigen Verfahren durch Angiogenese, in dem bereits bestehenden Netz von Kapillaren mit stark verzweigten und hierarchischen Strukturen neu organisiert ist gut etabliert. Obwohl zahlreiche Arbeiten haben gezeigt worden, dass eine Vielz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken K. Gill für die Unterstützung bei der Maus Zucht und Pflege sowie für Labor-Management. Danke auch an Mukoyama lab Mitglieder für technische Hilfe. Die Finanzierung wurde von Intramural Research Program der Nationalfeiertag Institutes of Health zur Verfügung gestellt.
Materials
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
| PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
| VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
| CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
| Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
| Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
| LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
| Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
| Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
| Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
| Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
| NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
| SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
| GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
| GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
| β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
| β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| 2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
| Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
| BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin．
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.
Referências
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
- Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
