Con tutto il supporto per l'analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione
Summary
Introduciamo un tutto-mount immunoistochimica e microscopia confocale a scansione laser con l'etichettatura per analizzare più intricata la formazione della rete vascolare nella pelle degli arti embrionali di topo.
Abstract
Tutto-mount analisi immunoistochimica per l'imaging la vascolarizzazione intera è fondamentale per la comprensione dei meccanismi cellulari di ramificazione morfogenesi. Abbiamo sviluppato la pelle modello vascolarizzazione degli arti per lo studio dello sviluppo vascolare in cui viene riorganizzato un preesistente primitivo plesso capillare in una rete ramificata gerarchicamente vascolare. Tutto-mount microscopia confocale con etichettatura più permette l'imaging con robusto dei vasi sanguigni intatti così come i loro componenti cellulari, comprese le cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce, utilizzando specifici marcatori fluorescenti. I progressi in questo modello vascolarizzazione della pelle degli arti con studi genetici hanno migliorato la comprensione dei meccanismi molecolari di sviluppo vascolare e patterning. La pelle modello vascolarizzazione degli arti è stato utilizzato per studiare come i nervi periferici fornire un modello spaziale per la differenziazione ed il modello delle arterie. In questo articolo video descrive un protocollo semplice e robusto per colorare i vasi sanguigni intatti vascolare con anticorpi specifici e anticorpi secondari fluorescenti, che è applicabile per vascolarizzato organi embrionali dove siamo in grado di seguire il processo di sviluppo vascolare.
Protocol
Discussion
Il sistema vascolare è fondamentale per lo sviluppo degli organi durante l'embriogenesi, nonché per la manutenzione degli organi e delle funzioni riproduttive negli adulti, in quanto fornisce sufficiente ossigeno e nutrienti agli organi. Adeguata rete vascolare è ben stabilita con processi complessi e multi-passo per l'angiogenesi in cui viene riorganizzato pre-esistente rete capillare di strutture fortemente ramificate e gerarchica. Sebbene numerose opere sono state dimostrato che una varietà di molecole è…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo K. Gill per l'assistenza con l'allevamento del mouse e cura e per la gestione del laboratorio. Grazie anche a Mukoyama membri laboratorio per assistenza tecnica. Il finanziamento è stato fornito dal programma di ricerca intramurale degli Istituti Naitonal della Salute.
Materials
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
| PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
| VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
| CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
| Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
| Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
| LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
| Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
| Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
| Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
| Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
| NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
| SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
| GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
| GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
| β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
| β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| 2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
| Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
| BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin．
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.
Referências
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
- Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
