胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム
Summary
我々はマウス胚の四肢の皮膚に複雑な血管網の形成を分析するために複数のラベルで共焦点顕微鏡を走査型ホールマウントの免疫組織化学とレーザーをご紹介。
Abstract
イメージングのためのホールマウント免疫組織化学分析は、全体の血管系は分岐形態形成の細胞メカニズムを理解するために極めて重要である。我々は、既存のプリミティブ毛細血管叢が階層的に分岐した血管網に再編成されている血管の発達を研究するために四肢の皮膚の血管系モデルを開発した。複数のラベルを持つホールマウント共焦点顕微鏡は、特定の蛍光マーカーを使用して、無傷の血管の堅牢な画像だけでなく、内皮細胞、周皮細胞および平滑筋細胞を含むそれらの細胞成分が可能になります。遺伝学的研究でこの四肢の皮膚の血管系モデルの進歩により、血管の開発とパターン形成の分子機構を理解改善している。四肢の皮膚の血管系のモデルは、末梢神経、動脈の分化とパターン形成のために空間的なテンプレートを提供する方法を研究するために使用されています。このビデオの記事では、我々は血管の開発のプロセスに従うことができる血管新生化胚の臓器に適用可能な血管特異的な抗体と蛍光二次抗体、で無傷の血管を染色するためのシンプルで堅牢なプロトコルを記述します。
Protocol
Discussion
それが臓器に十分な酸素と栄養を供給するので、血管系は、胚形成の間だけでなく、臓器のメンテナンスと成人の生殖機能のための器官の開発にとって極めて重要である。適切な血管網は、既存の毛細血管網が高度に分岐したと階層構造で編成されている血管新生により、複雑で多段階のプロセスで十分に確立されている。数々の作品は様々な分子がこれらのプロセスに関与しているこ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はマウスの繁殖と介護の支援のために、実験室の管理のためのK.ギルに感謝。また、技術的なヘルプのための向山研究室のメンバーに感謝します。資金は、保健のNaitonal研究所の学内研究プログラムによって提供されていました。
Materials
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
| PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
| VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
| CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
| Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
| Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
| LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
| Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
| Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
| Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
| Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
| NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
| SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
| GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
| GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
| β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
| β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| 2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
| Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
| BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin．
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.
Referências
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
- Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
