Summary
这里描述的是MG53介导的细胞在整个动物的膜修复，并在细胞水平上的动态过程可视化的协议。这些方法可以适用于调查的质膜再加盖印章和再生医学细胞生物学。
Abstract
急性损伤细胞膜的修复是一个正常的细胞生理学的元素的过程中，已与许多退化的人类疾病和有缺陷的膜修复。最近发现的膜再加盖印章机器的重要组成部分MG53允许以一个更好的组织修复的基础生物学，以及在再生医学的潜力翻译应用分子了解。 ：我们在体内的MG53的功能，在使用跑步机上锻炼的小鼠模型协议，用于测试测量到孤立的肌纤维的染料进入体内膜的修复能力，肌肉损伤的修复，探索和监控的动态过程详细的实验协议MG53 -介导的囊泡贩运和使用活细胞共聚焦显微镜培养细胞的细胞膜修复。
Protocol
1。跑步机在小鼠模型揭示肌肉损伤的程度上运行
- 建立运行协议期间使用的跑步机表面的角度。一般来说，平级或7 °和15 °度之间的角度下坡或上坡。一些跑步机有不可分割的仪器来调整倾斜，而有些则需要通过其他方式升高的跑步机。
- 前放置一个托盘下面的跑步机或蓝色实验室垫在跑步机上的动物在运行协议的任何废物收集动物。
- 运行小鼠前应驯化跑步机的环境。这涉及到电网和皮带驱动电机，但带不动（即定为0米/秒的速度），放置15分钟，在跑步机上的动物。
- 打开上的动机电网。通常可以使用脉冲的强度和频率上跑步机控制，但变化从一个制造商。一般来说，最大强度是不需要激励小鼠运行，高频率（至少每两秒一次），同时将提高遵守。
- 激活的跑步机带开始运行的协议。一个约5米/分的初始的速度应该用于为小鼠的热身期。可以加速跑步的速度缓慢，通常加入1-2米/分钟，每分钟在跑步机上开始。
- 动物在大多数协议的合规性，可以提高运行实验开始前，在温暖的速度为3至10天进行一系列的短期运行（5分钟）。
- 急性衰竭运动通常会涉及增加跑步机的速度随着时间的推移，直至最高速度（一般<30 M / M），是实现和保持，直到小鼠显示疲惫的迹象。用尽判断标准各有不同，但一般包括鼠标支出电网或电网连续5秒，而无需返回到跑步机表面上超过一半的时间。一个单独的鼠标是用尽后，它可以从跑步机可以记录和运行的总时间。
- 改变跑步机的角度，可用于急性运行试验，增加运动负荷（上坡角度）或诱发破坏性的离心收缩（有一个下坡的角度），肌纤维撕裂的细胞膜膜。伊文思蓝染料可以注入动物前使用作为一个组织学染料，以确定受损的肌肉纤维 2,3程序。
- 运行协议的耐力训练运动负荷的动物提供了一个长时间（个月），以生产的肌肉或心血管系统的重塑。热身过程与上面相同（步骤1.5），但最高速度一般较低，运行时间可能很长（> 1小时）。
- 完成运行小鼠后可以返回他们的笼子。跑步机通常会变得非常脏，而老鼠运行，特别是长期协议。这是必要的，通常用70％乙醇的喷雾，每次使用后清洁跑步机。
2。孤立的肌纤维膜的维修能力的体外检测，经过紫外线激光损伤
- 解剖，从鼠标脚的趾短屈肌（FDB）肌肉的表面层。首先，削减中线唯一开放的皮肤，同时注意不要破坏下面的肌肉，然后进行横向削减和消除皮肤。可以看出FDB肌肉（近端肌腱）的白色平面肌腱连接到跟骨骨。说白了单独由钳肌腱割断肌腱附着部位接近，抢钳自由肌腱，轻轻把它从周围组织中分离出来的FDB同时切割保持连接的结缔组织。见状远端肌腱分支FDB可能削减这些肌腱连接到更深一层的肌肉中删除个别数字。
- FDB肌束把1毫升的胶原酶溶液预先加热至37 ° C在1.5 mL Eppendorf管，胶带管在37℃轨道摇床的水平方向和摇晃65分钟200转。孵育时间可能会有所调整，以确保有足够的消化，这是由磨损的外观和肌肉苍白色指示。
- 小心地转移到1.5μL离心〜600 2.5的Ca 2 +台氏液管通过1毫升吸管与切端，有一个直径足以让消化捆绑轻松传递无中断的一角消化FDB包。轻轻翻转试管撼动从松散的纤维束。
- 剪下30μL枪头的diameter仅略高于肌束小（15至 - 直径在20微米）使用移液器吸管轻轻划到捆绑，然后推入解决方案。重复此过程，直到大部分的纤维脱离捆绑。
- 充分混匀，轻轻转动管脱钩纤维，玻璃底三角洲T盘上采取所需的金额和下降。隔离是有用的，需要在一个特定的协议盘纤维的数量效率的基础上，加载量将有所不同。剩下的纤维可以储存在4 ° C约6小时额外的研究，在管。
- 允许的菜，坐了5分钟不受干扰。这使得纤维坚持以玻璃底部的菜。
- 将配备的紫外激光共聚焦显微镜上的玻璃见底菜。 > 100X倍率相差显微镜下观察纤维检查存在一个正常的条纹图案和一条直线状杆。
- FM1 - 43或4 FM4 - 64 styrylpyridinium染料添加到终浓度为2.5微米5解决方案。
- 为了诱导损伤纤维的位置，它在成像窗口，使纤维为导向，在一个45 °角，从右下角的视野（图1）左上方。照射5x5的像素使用紫外激光（80兆瓦或更大，364分之351纳米）设置为5秒的最大功率的等离子体膜的面积（约0.9μmx0.9μm）。照射区域应分开质膜;就是5x5的方块的一半应纤维内部，而其余的应该是外纤维（图1）。
- 捕捉到每5秒的时间间隔纤维的染料进入长达5分钟的图像。
- 重复步骤菜不超过3％纤维2.8，荧光染料，最终将被吞噬成纤维和复杂化的任何数据分析。 3纤维后，应准备一个新菜，从步骤2.5。
- 分析，通过计算每个捕获帧之间的荧光强度的变化（ΔF/ F 0）测量量的染料进入的数据。这需要测量的一个面积约200微米的平均荧光 2使用分析软件，如公开ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）。纤维之间的比较，下面的计算，应为每个帧：ΔF/ F 0，其中f 0是感兴趣的区域的平均荧光，在第一个捕获帧（T = 0;之前受伤），和ΔF在其后每帧的荧光变化（FF） 。
3。活细胞共聚焦成像监视器细胞膜修复的动态过程
- 从PYREX毛细血管微量移液器。毛细管被放置在一个微量拉马，由预先设定的程序（热= 695;拉= 50;的Vel .= 55;时间= 250）拉。
- 微管连接到一个3轴（XYZ）显微。
- 细胞转染质粒DNA使用正常的方法在玻璃底部三角洲T菜。媒体应切换到2.5MM的Ca 2 +台氏缓冲在实验开始前。
- 玻璃菜含有转染细胞分别置于激光扫描共聚焦显微镜40X 1.3NA油浸物镜。
- 活细胞急性损伤是由微管插入细胞膜，然后迅速收回的微量细胞3,6。连续活细胞图像获得间隔为1.54秒/帧。
- 皂甙诱导的膜破坏试验，在2.5mm 的钙皂甙0.005％（Sigma公司）+台氏缓冲液灌注重力流定制组装灌注系统 7 。灌注率约1毫升/分钟和灌注提示应直接放在上述成像细胞。
4。代表性的成果：
一个鼠标的跑步机上跑步的代表电影，可在拍摄过程中。这部影片将说明的降低运行能力的mg53 - / -小鼠由于骨骼肌损害。
上面详细的协议紫外激光损伤造成的损害程度取决于分析纤维膜的修复能力。这种能力是影响纤维分离的鼠标的基因型，外条件，和蛋白表达（转染或感染）的任何改变。一个正常的野生型纤维将允许轻度至中度染料项目（图2a）。肌肉纤维派生从mg53 - / -小鼠膜修复能力受损，会显示更重要的染料进入纤维（图2b） 。
典型的结果显示电极损伤易位MG53含vesiCLES到损伤部位。图3a和3b显示GFP - MG53转染C2C12肌管插入到细胞膜上的微量损坏。在微管损坏前的细胞，GFP - MG53是位于细胞膜和细胞质 3 。微量渗透，GFP - MG53含有囊泡移向损伤位点（箭头表示）。图3c所示的GFP - MG53转染C2C12成肌细胞治疗与0.005％的皂素，清洁剂，可以通透质膜。皂甙治疗后，GFP - MG53从细胞质易位到细胞膜。
魏斯勒德，等。图1。光纤对准和损伤区域定义。所示的伤害地区的观点和定义领域内的孤立的肌纤维的正确方向。
魏斯勒德，等。图2。紫外激光损伤的FDB光纤图像显示纤维损伤（0秒，左）和200秒伤后（右）。从野生型小鼠（一）的纤维显示轻伤。膜修复受损的小鼠的纤维（二）让更多的染料进入。
魏斯勒德，等。图3。微电极和皂甙培养细胞的损害 。图像显示C2C12成肌管（A，B）和一个C2C12成肌细胞的损伤（以上）和伤后（下）（三）前。用微电极（A，B）受伤的细胞显示MG53移位到损伤部位（箭头）。皂素（C）处理的细胞显示MG53易位到细胞膜。
Discussion
跑步机上跑步是一种有用的方法治疗的动物提供一个运动负荷。作为测量肌肉的功能或续航能力方法，它是出了名的嘈杂的方法，是难以执行， 一贯重现时尚8。在一般情况下，消耗体力的时间可以被用来作为终点，以解决重大的实验组之间的差异，如之间的一些基因敲除小鼠的线条和野生型小鼠9。产生更微妙的差异，如一些药品试验，实验操作，可能不会解决上述这种技术带来的噪音的差异。为了最大限度地发挥这些技术的重复性和灵敏度，重要的是保持在会话的条件非常密切。一天的时间行使的动物，以及作为热身期间使用条件，都是重要的因素，从审判审判应保持一致。
应变效应可以跑步机协议的设计上有重大影响，跑步机比其他品系小鼠的某些菌株可以运行更多的时间和不同的反应耐力运动10。作为一般指引，许多小鼠将能够运行在跑步机的速度不断的增加（5 M / M 1 M / M的初始速度为每分钟后开始添加）在用尽研究200-300平方米。对于耐力运动的老鼠可以运行9日至12日之间的M / M 2或30分钟，每周3次。然而，个别的研究，通常会需要一些协议，以配合个别的实验需要优化。
紫外激光损伤过程已被证明是一个有效的方法用于测量骨骼肌纤维膜3,6,11修复能力。这些实验的成功的一个重要组成部分，是只使用肌纤维显示一条直线，杆形美观的条纹的规律和平稳，不会出现皱纹肌膜。如果选择其他的肌肉纤维膜破坏，可能已经在这些纤维和从这些实验结果的解释可能是复杂的。同样重要的是，在图1中定义的纤维方向和照射区域的定义。这提供了一个重复性大小的损伤，从而使纤维之间的比较。如果损伤定义的区域内完全在于纤维，内伤将被创建，而不是破坏肌膜。此外，ΔF/ F 0的计算值是非常敏感的地区平均荧光测量选定的利益。面积大约为200μm2，和包括损伤部位附近，是适当的。受伤定义的区域不同，这方面应该完全躺在内的纤维。如果包括纤维以外的空间，由此产生的空白区域将增加小染料进入纤维 ΔF/ F 0，同时降低更严重的表型纤维ΔF / F 0。这降低了检测的灵敏度，从而使纤维间的比较困难。
对于微量的损伤检测，之间的微管和玻璃底菜的角度应约45度，为了有效地破坏细胞膜。被选为细胞微管损坏，应紧紧地贴盘底部和圆润的细胞不应该，因为最有可能，他们将分离后微量戳。皂素permeabilzation实验技术要求高，相对更快地执行比较微量渗透检测。不过，也有一些局限性皂素的损害，包括只有一个细胞，每皿可用于以来皂素会扩散并破坏其他细胞，菜。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | ||
| 70 % ethanol | ISC Bioexpress | ||
| Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 2 mg/ml collagenase type I | Sigma-Aldrich | ||
| 0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| 2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 | |
| LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | ||
| Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | MHW-3 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
References
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