En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa
Summary
Esfuerzos para aislar a la subunidad catalítica de la telomerasa, TERT, en cantidades suficientes para realizar estudios estructurales, han tenido un éxito limitado desde hace más de una década. En este sentido, los actuales métodos para el aislamiento de la recombinación del TERT Tribolium castaneum (<em> Tc</em> TERT) y la reconstitución de los activos<em> T. castaneum</em> Telomerasa ribonucleoproteína (RNP) complejo<em> In vitro</em>.
Abstract
Esfuerzos para aislar a la subunidad catalítica de la telomerasa, TERT, en cantidades suficientes para realizar estudios estructurales, han tenido un éxito limitado desde hace más de una década. En este sentido, los actuales métodos para el aislamiento de la recombinación del TERT Tribolium castaneum (Tc TERT) y la reconstitución de la T. activos telomerasa castaneum ribonucleoproteína (RNP) complejos in vitro.
La telomerasa es una transcriptasa reversa especializada 1 que añade repeticiones cortas de ADN, llamados telómeros, al extremo 3 'de los cromosomas lineales dos que sirven para protegerse de la fusión de extremo a extremo y la degradación. Después de la replicación del ADN, un segmento corto se pierde al final del cromosoma 3, y sin telomerasa, las células siguen dividiendo hasta que finalmente llegando a su límite Hayflick 4. Además, la telomerasa está inactiva en la mayoría de las células somáticas cinco en adultos, pero está presente en seis células de cáncer en la que promueve la inmortalidad celular 7.
La enzima telomerasa mínima consta de dos componentes básicos: la subunidad de la proteína (TERT), que comprende la subunidad catalítica de la enzima y un componente integral de ARN (TER), que contiene el TERT plantilla utiliza para sintetizar telómeros 8,9. Antes de 2008, sólo las estructuras de los dominios individuales de la telomerasa se había resuelto 10,11. Un gran avance en este campo llegó a la determinación de la estructura cristalina de los 12 activos, subunidad catalítica de la T. telomerasa castaneum, Tc TERT 1.
Aquí, se presentan métodos para producir grandes cantidades de TERT activo, soluble Tc para estudios estructurales y bioquímicos, y la reconstitución del complejo RNP telomerasa in vitro para los ensayos de actividad de la telomerasa. Una visión general de los métodos experimentales utilizados se muestra en la Figura 1.
Protocol
Discussion
El método aquí presentado permite la producción de grandes cantidades de la subunidad catalítica de la T. castaneum TERT de la telomerasa en forma soluble y activa para realizar estudios estructurales y bioquímicos. El método de Tc TERT sobre-expresión es sensible a los cambios sutiles en la temperatura o la densidad de las células de las arriba indicadas y puede afectar dramáticamente los niveles de expresión de la proteína. En concreto, hemos encontrado que la inducción de las células pa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación presentada aquí fue apoyado por el Departamento de Salud de Pennsylvania, la Asociación Médica Ellison, V y Los fundamentos de esmeralda.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
Referências
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