在体外重组活跃T。谷盗端粒酶
Summary
努力找出端粒酶的催化亚基，叔，足够数量结构研究，已会见了十余有限的成功。在这里，我们目前的重组赤拟谷盗叔隔离的方法（<em> TC</em>叔）和重组活动<em> T。谷盗</em>端粒酶的核糖核蛋白（RNP）复合物<em>在体外</em>。
Abstract
努力找出端粒酶的催化亚基，叔，足够数量结构研究，已会见了十余有限的成功。在这里，我们目前的重组赤拟谷盗叔（TC叔）的分离和重组的积极 T.方法谷盗端粒酶的核糖核蛋白（RNP）复合物在体外 。
端粒酶是一个专门的反转录酶1，增加了短的DNA重复序列，称为端粒，线性染色体 2，有利于保护他们从终端到终端的融合和退化的3'端。短段DNA复制，失去了在3号染色体的结束，如果没有端粒酶，细胞继续分裂，直至最终达到他们海弗利克极限4。此外，端粒酶在大多数体细胞在成人的 5中处于休眠状态，但活跃于癌细胞，促进细胞不死7。
最小的端粒酶由两个核心部分组成：蛋白亚基（叔），其中包括酶的催化亚基和一个完整的RNA组分（TER），其中包含的模板叔使用合成端粒8,9。在2008年之前，只有个别端粒酶域的结构已经解决了10,11。在这一领域的一个重大突破来自活跃的 12晶体结构测定，T的催化亚基谷盗端粒酶，TC叔1。
在这里，我们目前生产大量的活性，可溶性TC叔结构和生化研究，并重组端粒酶活性检测端粒酶在体外的RNP复杂的方法。使用的实验方法概述如图1所示。
Protocol
1。表达的重组TC叔从六个新鲜板用的TEV裂解N -端含有合成TC叔质粒转化罗塞塔（DE3）pLysS中细胞接种6升（6 × 2升困扰锥形瓶包含在每1 L 2YT肉汤）2YT媒体hexahistidine标签。 细胞增长在37 ° C，而在220转的0.5-0.6一个外径600的摇晃。 加入1 mM的IPTG诱导蛋白表达。 降低温度至30 ° C，缓慢摇动至150转，让细胞表达蛋白质为4-5小时离心收集细胞在4 ?…
Discussion
这里介绍的方法可以为大量生产的T 的催化亚基谷盗可溶性活性形式，结构和生化研究端粒酶叔。 TC叔过度表达的方法是敏感微妙的变化，在温度或从上述这些细胞密度和蛋白表达水平可以显着地影响。具体来说，我们发现，诱导蛋白表达的细胞之前，在600 nm的光密度达到0.5，或降低温度至30 ° C诱导前，在蛋白质产量显着减少。
在净化方面，TC叔蛋…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这里介绍的研究是由宾夕法尼亚州的卫生署，埃利森医学，V和祖母绿基础支持。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
Referências
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Citar este artigo
Schuller, A. P., Harkisheimer, M. J., Skordalakes, E. In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase. J. Vis. Exp. (53), e2799, doi:10.3791/2799 (2011).