In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase
Summary
Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT (<em> Tc</em> TERT) und die Wiederherstellung der aktiven<em> T. castaneum</em> Telomerase ribonucleoprotein (RNP)-Komplex<em> In-vitro-</em>.
Abstract
Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) und die Wiederherstellung der aktiven T. castaneum Telomerase ribonucleoprotein (RNP)-Komplex in vitro.
Telomerase ist ein spezialisierter Reverse-Transkriptase-1, die kurze DNA-Wiederholungen, die Telomere, die 3 'Ende der linearen Chromosomen 2, die ihnen von End-to-End-Fusion und Abbau zu schützen dienen hinzu. Nach DNA-Replikation, ein kurzes Segment am Ende des Chromosoms 3 und ohne Telomerase ist verloren, weiterhin Zellen, bis schließlich der Erreichung ihrer Hayflick Limit 4 geteilt. Darüber hinaus ist die Telomerase ruhend in den meisten somatischen Zellen 5 bei Erwachsenen, sondern ist aktiv in Krebszellen 6, wo es fördert Zelle Unsterblichkeit 7.
Die minimale Telomerase-Enzym besteht aus zwei Kernkomponenten: die Protein-Untereinheit (TERT), welche die katalytische Untereinheit des Enzyms und ein integraler RNA-Komponente (TER), der die Vorlage TERT verwendet, um Telomere 8,9 synthetisieren enthält umfasst. Vor 2008 hatten nur Strukturen für einzelne Telomerase-Domänen 10,11 gelöst. Ein wichtiger Durchbruch auf diesem Gebiet kamen aus der Bestimmung der Kristallstruktur der aktiven 12, katalytische Untereinheit von T. castaneum Telomerase, Tc TERT 1.
Hier stellen wir Verfahren zur Herstellung von großen Mengen des aktiven, löslichen Tc TERT für strukturelle und biochemische Untersuchungen, und die Wiederherstellung der Telomerase RNP-Komplex in vitro für Telomerase-Aktivität Assays. Eine Übersicht über die experimentellen Methoden ist in Abbildung 1 dargestellt.
Protocol
Discussion
Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Produktion von großen Mengen der katalytischen Untereinheit von T. castaneum Telomerase TERT in lösliche aktive Form für strukturelle und biochemische Untersuchungen. Die Methode der Tc TERT Überexpression empfindlich auf subtile Veränderungen in Temperatur oder Zelldichte von den oben dargestellten und können dramatisch beeinflussen die Höhe der Proteinexpression. Insbesondere haben wir festgestellt, dass Induktion der Zellen für die Proteinexpress…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung hier vorgestellte wurde von der Pennsylvania Department of Health, der Ellison Medical, Der V und The Emerald Stiftungen unterstützt.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
Referências
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