In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase
Summary
Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT (<em> Tc</em> TERT) en de reconstructie van de actieve<em> T. castaneum</em> Telomerase ribonucleoproteïne (RNP) complex<em> In vitro</em>.
Abstract
Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) en de reconstructie van de actieve T. castaneum telomerase ribonucleoproteïne (RNP) complex in vitro.
Telomerase is een gespecialiseerde reverse transcriptase een die korte DNA-herhalingen, de zogenaamde telomeren, aan het 3 'einde van lineaire chromosomen 2 die dienen om hen te beschermen tegen end-to-end-fusion en degradatie toevoegt. Na DNA-replicatie, een kort segment verloren gaat aan het einde van het chromosoom 3 en zonder telomerase, blijven cellen te delen totdat uiteindelijk het bereiken van hun Hayflick Limit 4. Bovendien, telomerase inactief is in de meeste somatische cellen 5 bij volwassenen, maar is actief in kankercellen 6, waar het bevordert de cel onsterfelijkheid 7.
De minimale telomerase enzym bestaat uit twee kerncomponenten: het eiwit subunit (tert), die de katalytische subeenheid van het enzym en een integraal RNA-component (TER), waarin de sjabloon TERT gebruikt om te synthetiseren telomeren 8,9 omvat. Vóór 2008 had alleen de structuren voor de individuele telomerase domeinen opgelost 10,11. Een belangrijke doorbraak op dit gebied kwam van de bepaling van de kristalstructuur van de actieve 12, katalytische subeenheid van T. castaneum telomerase, Tc TERT 1.
Hier presenteren we methoden voor het produceren van grote hoeveelheden van het actieve, oplosbare Tc TERT voor structurele en biochemische studies, en de reconstructie van de telomerase RNP complex in vitro telomerase activiteit assays. Een overzicht van de gebruikte experimentele methode is weergegeven in figuur 1.
Protocol
Discussion
De hier gepresenteerde methode zorgt voor de productie van grote hoeveelheden van de katalytische subeenheid van T. castaneum telomerase TERT in oplosbare, actieve vorm van structurele en biochemische studies. De methode van Tc TERT over-expressie is gevoelig voor subtiele veranderingen in temperatuur of celdichtheid van de hierboven vermeld en kan drastisch invloed hebben op de niveaus van eiwitexpressie. In het bijzonder, hebben we gevonden dat het induceren van de cellen voor proteïne-expressie voo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek dat hier werd ondersteund door de Pennsylvania Department of Health, The Ellison Medical, De V en The Emerald stichtingen.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
Referências
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H. Telomeres: no end in sight. Cell. 77, 621-623 (1994).
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
