Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton
Summary
Bacterioplankton הסביבה מודגרת עם מודל מומס פחמן אורגני (DOC) המתחם מגיב תיוג DNA, bromodeoxyuridine (BrdU). לאחר מכן, DOC-משפיל תאים מופרדים מן הקהילה בתפזורת מבוסס על שילוב גבוהות BrdU שלהם באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS). תאים אלה מזוהים מכן על ידי מנתח מולקולרית שלאחר מכן.
Abstract
חיידקים הם סוכני התיווך העיקריים את ההשפלה של פחמן אורגני מומס רבים (DOC) מצעים בסביבות מימיים. עם זאת, זיהוי מינים חיידקים שהופכים בריכות ספציפיים של DOC בטבע מהווה אתגר טכני.
כאן אנו מתארים גישה זוגות bromodeoxyuridine (BrdU) ההתאגדות, תא הקרינה מיון מופעל (FACS), ו – 16S rRNA ניתוח מולקולרי גנטי המבוסס המאפשר תרבות עצמאית זיהוי bacterioplankton מסוגל מתחם DOC משפיל ספציפי בסביבות מימיים. Bacterioplankton מיקרוקוסמוס בשלושה עותקים מוגדרים לקבל הן BrdU ו תרכובת DOC מודל (DOC תיקונים), או רק BrdU (ללא תוספת שליטה). תחליפי BrdU עמדות thymidine ב-DNA חיידקי מסונתז החדש ו-BrdU שכותרתו DNA ניתן 1,2 immunodetected בקלות. באמצעות bacterioplankton 24 שעות דגירה, כי הם מסוגלים להשתמש במתחם הוסיף DOC צפויים להיות מופעלים באופן סלקטיבי, ולכן יש רמות גבוהות יותר של שילוב BrdU (תאים HI) מאשר אי – היענות תאים התיקונים DOC ו תאים ללא בנוסף שולטת (נמוך תאים BrdU ההתאגדות, תאים LI). לאחר immunodetection פלואורסצנטי, HI תאים נבדלים ו מופרדים פיזית על ידי מיון הקרינה התא הפעיל (FACS) 3 מתאי LI. ממוין DOC-מגיבים תאים (תאים HI) המחולצים עבור דנ"א שזוהו טקסונומית באמצעות 16S rRNA הבאים הגן מבוססי ניתוח כולל PCR, שיבוט בנייה ספריה וסדר.
Protocol
Discussion
זוגות הגישה שלנו ההתאגדות BrdU, FACS ו 16S ניתוח rDNA כדי לאפשר זיהוי ברמת המין של bacterioplankton כי לעכל רכיבים בודדים DOC בסביבות מימיים. Assay ההתאגדות BrdU תוויות תאים חיידקיים מבוסס על פעילות מטבולית, המאפשר ניתוח רק על חיידקים פעילים, ולכן אינה כוללת תאים רדומים. בגישה שלנו, ההתאגד?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון פרויקט זה סופק על ידי הקרן הלאומית למדע מענקים OCE1029607 (עד XM) ו MCB0702125 (אל MAM) ואת גורדון ובטי מור קרן (אל MAM).
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
Referências
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
