Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton
Summary
Çevre bacterioplankton bir model ile çözünmüş organik karbon (DOC) bileşik ve bir DNA etiketleme reaktif bromodeoxyuridine (BrdU) inkübe edilir. Daha sonra floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak kendi yükseltilmiş BrdU dahil dayalı toplu topluluk, DOC-aşağılayıcı hücreleri ayrılır. Bu hücreler daha sonra sonraki moleküler analizleri ile tespit edilir.
Abstract
Mikroplar sucul ortamlarda pek çok çözünmüş organik karbon (DOC) yüzeylerde bozulması aracılık önemli ajanlardır. Ancak, doğada DOC özel havuzları dönüştürmek bakteri taksonların belirlenmesi teknik bir sorun teşkil etmektedir.
Burada bir yaklaşım tarif çiftler bromodeoxyuridine (BrdU) dahil, floresan aktif hücre sıralama (FACS) ve 16S rRNA gen tabanlı sucul ortamlarda aşağılayıcı belirli bir DOC bileşik yetenekli bacterioplankton kültür-bağımsız bir kimlik sağlar moleküler analizler. Üç kat bacterioplankton microcosms BrdU ve bir model DOC bileşik (DOC değişiklikler), ya da sadece BrdU (no ek kontrol) almak için ayarlanır. Yeni sentezlenmiş bakteriyel DNA ve BrdU-işaretli DNA timidin BrdU yerine pozisyonları kolayca immunodetected 1,2 olabilir. Katma DOC bileşik seçici aktive olması beklenen ve bu nedenle hiçbir BrdU esas DOC değişiklikler ve hücre dışı duyarlı hücreler daha yüksek seviyelerde (HI hücreleri) vardır kullanabilmek 24 saat inkübasyon, bacterioplankton sayesinde Ayrıca kontroller (düşük BrdU dahil hücreleri LI hücreleri). Floresan İmmuno sonra, HI hücreleri ayırt edilirler ve fiziksel floresan aktive hücre sıralama (FACS) 3 LI hücreleri ayrılır. Sıralama DOC-duyarlı hücreleri (HI hücreleri) DNA ayıklanır ve taksonomik rRNA gen-temelli analiz PCR, klon kütüphane yapım ve sıralama da dahil olmak üzere sonraki 16S ile tanımlanır.
Protocol
Discussion
Bizim yaklaşımımız çiftler BrdU bir FACS ve 16S rDNA analiz sucul ortamlarda bireysel DOC bileşenleri metabolize bacterioplankton tür düzeyinde kimlik izin vermek. BrdU dahil tahlil bakteri hücrelerinin metabolik faaliyetleri, sadece aktif bakteri analizi sağlar ve böylece uyuyan hücreleri içermez dayalı etiketler. Bizim yaklaşımımız, BrdU dahil, sonradan görselleştirildiği BrdU esas farklı düzeylerde immunodetected yerinde ve bakteri FACS kullanarak gruplandırılmış ve sıralanmış. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu projenin finansmanı Ulusal Bilim Vakfı hibe OCE1029607 (XM) ve MCB0702125 (MAM) ve Gordon ve Betty Moore Vakfı (MAM) tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalog number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |
Referências
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
