Summary
Vi presenterar ett protokoll för strukturella och analysen av sammansättningen av naturliga orala biofilmen från tandställningar med
Abstract
Konfokala laserskanning mikroskopi (CLSM) av naturliga heterogena biofilm idag underlättas av ett omfattande sortiment av färgningsteknik, en av dem är fluorescens in situ hybridisering (FISH). 1,2 Vi har genomfört en pilotstudie där orala biofilmen prover som tagits från fasta tandställningar (palatinala expansionsturbiner) färgades av fiskar, eftersom målet är att bedöma den tredimensionella organisationen av naturliga biofilm och plack ackumulering. 3,4 FISK skapar en möjlighet att färga cellerna i sitt ursprungliga biofilmen miljön genom användning av fluorescerande 16S rRNA-targeting sonder. 4-7,19 jämfört med alternativa tekniker som immunofluorescens märkning, detta är ett billigt, exakt och enkel märkning teknik för att undersöka olika bakteriella grupper i blandade biofilmen konsortium. 18,20 Allmänna sonder användes som binder till eubakterier ( EUB338 + EUB338II + EUB338III; nedan EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. Fanns nedan LGCmix), 9,10 och Bacteroidetes (Bac303) 11 Dessutom specifika prober bindning till Streptococcus mutans (MUT590) 12,13 och Porphyromonas gingivalis (postgiroinstitutet) 13,14 användas . Den extrema hårdheten hos de inblandade ytan material (rostfritt stål och akrylharts) tvingade oss att hitta nya sätt att förbereda biofilm. Eftersom dessa ytmaterial inte kunde lätt skäras med en cryotome var olika provtagningsmetoder utforskas för att få intakta oral biofilm. Den mest användbara av dessa synsätt presenteras i detta meddelande. Små flingor av biofilmen som bär akrylharts var skrapas bort med en steril skalpell och var noga med att inte skada biofilm struktur. Tång har använts för att samla biofilm från stålytor. När samlas in, var de prover fast och placeras direkt på polysine belagt glas diabilder. FISH utfördes direkt på de här bilderna med sonder mentioned ovan. Olika FISH protokoll slogs ihop och modifieras för att skapa ett nytt protokoll som var lätt att hantera. 5,10,14,15 Därefter proverna analyserades med konfokala laserskanning mikroskopi. Välkända konfigurationer 3,4,16,17 kan visualiseras, inklusive svamp-stil formationer och kluster av kockoida bakterier genomsyras av kanaler. Dessutom var den bakteriella sammansättningen av dessa typiska biofilm strukturer analyseras och 2D-och 3D-bilder skapas.
Protocol
1. Provtagning
- Ta fasta palatinala expansionsturbiner efter 4 månader av intraoral tjänst. Använd NOLA Torr Fält System för att isolera apparater innan du tar bort dem (figur 1 och 2).
- Använd sterila tänger, handskar och brickor för att ta bort expansionsturbiner utan att lägga föroreningar (figur 3 och 4).
- Lagra objekt i Sarstedt 120 ml flaskor vid -20 ° C. Ta till laboratoriet på is och process inom 24 timmar.
2. Biofilm fixering
- Skrapa bort biofilmen flingor med en steril skalpell, eller samla bitar med steril pincett.
- Tillsätt iskallt 4% PFA-lösning tills provet är väl täckt.
- Inkubera blandningen vid +4 ° C (får ej frysas) 3 till 12 timmar. Längre fixering gånger eller högre temperaturer fixering kan medföra att cellen kuvert av gramnegativa cellerna mindre genomsläpplig för oligonukleotid sonder.
- Ta bort PFA lösning och tvätta med iskall 1X PBS. Upprepa detta steg 2-3 gånger för att rEFlytta kvarvarande PFA.
- Resuspendera provet i 1 vol. iskall 1X PBS och tillsätt 1 vol. iskalla 96% (v / v) etanol.
- Förvara provet vid -20 ° C. Prover som fastställs enligt detta protokoll kan lagras i flera månader till år.
3. Uttorkning av fasta prover
- Applicera 5-30 l av PFA-fast provmaterial till ett objektglas.
- Torka vid 46 ° C i ca 15 min eller i rumstemperatur längre. Tina lysozym och formamid.
- Tillsätt 250 l av lysozym (1mg/ml) i rumstemperatur i 10 min, vilket underlättar penetration av sonder in i cellerna genom partiella förstörelsen av cellväggar.
- Doppa glida in 50%, 80% och 96% (v / v) etanol i 3 min vardera. Den uttorkande effekten av etanol koncentration serien kommer att upplösas cellmembranen.
- Torka objektglasen vid 46 ° C i 10 min.
4. In-situ hybridisering
- Bered 1 mlfärska hybridisering buffert (se tabell 1 för koncentrationer). Formamid koncentrationer som används i denna studie: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, postgiroinstitutet, MUT590) eller 45% (LGCmix).
- Tina oligonukleotid sond lösningar. Upptinade sonder bör hållas på is och skyddas från ljus.
- Tillsätt 2 l av varje givare till 200 l av hybridisering buffert, blanda väl och lägg blandningen på dehydrerade prov på ett objektglas.
- Placera en bit silkespapper i en kvadrat petriskål och häll resterande hybridisering buffert på mjukpapper.
- Placera omedelbart objektglaset horisontellt i skålen och stäng skålen. Inkubera i ugn vid 46 ° C i 1-5 timmar (90 min kommer att räcka i de flesta fall). Skålen fungerar som en fukt kammare hindrar avdunstning av hybridisering lösning från bilden. I synnerhet kan avdunstning av formamid orsaka icke-specifik probe bindning till icke-målceller.
- Förbered 50 ml tvättbuffert (se tabell 2 för concentrations). Förbered tvättlösningen i en 50 ml tub och värm till 48 ° C i ett vattenbad. Tvätten steget utförs vid 48 ° C.
- Ta ut skålen med bilden från hybridisering ugnen. Tvätta omedelbart bort hybridisering bufferten med en liten volym förvärms tvätt buffert, och överför bilden till resterande tvätt buffert.
- Placera röret med tvättlösningen och skjut tillbaka i vattenbadet och inkubera vid 48 ° C i 10-15 min.
- Ta bort bilden från tuben och doppa i iskallt DDH 2 O i 2-3 sekunder för att avlägsna kvarvarande tvätt buffert.
- Lufttorka bilden så snabbt som möjligt (användning av tryckluft rekommenderas). Snabbtorkande kommer att minska sond dissociation.
- Torkade bilderna kan lagras i mörker vid -20 ° C i flera veckor utan att förlora stora prob tilldelats-fluorescens signal.
5. Mikroskopi
- Efter FISK och tvätt, apply två droppar antifadent nära till vänster och höger ändarna av en bild (frysta skivor bör värmas upp till rumstemperatur före detta steg).
- Placera ett mikroskop täckglas ovanpå och vänta tills antifadent har spridit över hela bilden. Observera att en överdriven mängd antifadent kan sudda mikroskop bilden.
- Observera prov under en konfokala laserskanning mikroskop utrustat med lämpliga filter eller laser. Vi använde en Leica TCS enhet (HCx PL APO/63x, NA 1,2). Data kan analyseras med program som IMARIS eller AMIRA.
- Diabilder inbäddad i antifadent kan förvaras i +4 ° C (får ej frysas) i upp till 7 dagar innan probe-tilldelats fluorescens börjar avta. Alternativt kan antifadent tas bort med DDH 2 O, och den torkade bilderna kan lagras vid -20 ° C under en längre tid.
6. Representativa resultat:
Skrapning biofilm av fasta tandställningar (Figur 5) ger lämplig flingor (Figur 6) som kan hybridiseras direkt på belagt glas diabilder för mikroskopi. På detta sätt kan olika grupper av orobiome bakterier identifieras i deras naturliga tredimensionella miljön genom att tagga bakteriell rRNA med olika märkta särskilda sonder (figur 7 och 8). I Figur 7, var biofilmen färgas med EUBmix (grön, alla bakterier) och LGCmix (gul, Firmicutes). Firmicutes visas i grönt, eftersom de var färgade med gula och blå. I Figur 8, var biofilmen färgas med EUBmix (röd, alla bakterier), Bac303 (blå, Bacteroidetes) och postgiroinstitutet (gul, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis visas i gulvit, eftersom alla tre sonder binda till dess DNA och överlappningen av färger resulterar i en vit signal. Morfologiska skillnader mellan grupper av bakterier kan också identifieras (diagram 9 och 10). Stora kluster av kockoida bakterier visas i figur 9, där färgning utfördes med EUBmix (grön, alla bacteria). Olika former av muntliga bakterier visualiseras i figur 10, där kockoida och trådformiga bakterier kan urskiljas genom färgning med EUBmix (röd). Dessutom kan en typisk svamp-liknande struktur biofilm bearbetas via 3D-modellering av CLSM data (figur 11 och 12) Klicka här för att se en film i 3D-modellering.
Figur 1. Fasta palatinala expander på plats.
Figur 2. Nola Torrt Fält System.
Figur 3. Steriliserad tänger, handskar och facket.
Figur 4. Borttagen expander.
Figur 5. Skrapa bort biofilmen med en steril skalpell.
Figur 6. Resin flingor hybridiseras direkt på belagt glas diabilder.
Figur 7 CLSM bild:. Differentiering av en specifik bakterie grupp. 2D överlagring av 3D-data CLSM stacken. Biofilm färgas med EUBmix (grön, alla bakterier) och LGCmix (gul, Firmicutes).
Figur 8 CLSM bild:. Differentiering av en specifik bakterie grupp. 2D överlagring av 3D-data CLSM stacken. Biofilm färgas med EUBmix (röd, alla bakterier), Bac303 (blå, Bacteroidetes) och postgiroinstitutet (gul, Porphyromonas gingivalis).
Figur 9 CLSM bild:. Differentiering av specifika morfologier. 2D överlagring av 3D-data CLSM stacken. Biofilm färgas med EUBmix (grön, alla bakterier). Stora kluster av kockoida bakterier (pilar).
. Figur 10 CLSM bilder: differentiering av specifika morfologier. 2D överlagring av 3D-data CLSM stacken. Biofilm färgas med EUBmix (röd, alla bakterier). Kockoida (pil nedan) och fintrådiga bakterier (pilen ovan) kan urskiljas.
Figur 11. Mushroom struktur, 3D-vyer underifrån. Staplar av biofilm flingor (skrapade på ytan av en ortodontisk apparat), färgade med EUBmix och rutinerssed med IMARIS (CLSM bild).
Figur 12. Mushroom struktur, 3D-vy från sidan. Staplar av biofilm flingor (skrapade på ytan av en ortodontisk apparat) bearbetas med IMARIS (CLSM bild).
| Hybridisering buffert (200 l) | |||
| Formamid koncentration | 10% | 20% | 45% |
| 5 M NaCl | 36 | 36 | 36 |
| 1 M Tris-HCl | 4 | 4 | 4 |
| 2% SDS | 1 | 1 | 1 |
| FA | 20 | 40 | 90 |
| 138 | 118 | 68 | |
| Någon fisk sond | 2 | 2 | 2 |
Tabell 1. Beståndsdelar av hybridisering buffert (koncentrationer i l).
| Tvätt buffert (50 ml) | |||
| Formamid koncentration | 10% | 20% | 45% |
| 5 M NaCl | 4500 | 2150 | 300 |
| 1 M Tris-HCl | 1000 | 1000 | 1000 |
| 0,5 M EDTA | 0 | 500 | 500 |
| DDH 2 O | 44 500 | 46 350 48 200 | |
Tabell 2. Beståndsdelar i tvätt-buffert (koncentrationer i l).
Film 1. Klicka här för att se filmen.
Discussion
Protokollet beskrivs nedan är en mycket användbar metod för färgning biofilmer samlas in från hårda material. Provtagning och hybridisering är de mest kritiska stegen. Under provtagningen måste man se till att skivor av tillräcklig tjocklek samlas för att säkerställa att biofilmen strukturen är intakt. Under hybridisering, är det viktigt att undvika alltför stora variationer i temperatur, för att undvika icke-specifik bindning, eller förlust av bindande för fluorescerande prober. Denna fisk-protokollet är en elegant metod att färga normala heterogena biofilm direkt på glaset glider utan att störa dess sammansättning. Bilderna kan omedelbart användas för mikroskopi utan att behöva flytta provet igen. På detta sätt är en förbättring jämfört färgning i rören uppnås genom mindre skärkraft tillämpas på biofilmen. Slices> 50 ìm tjocka kan förberedas och utredas på detta sätt.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av hygien Fonds av Medical University Graz. Alla försökspersoner gav sitt informerade samtycke. Institutionella godkännande av studien protokollet erhölls från Medical University Graz.
References
- Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
- Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
- Kolenbrander, P. E.
- Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
- Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
- Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
- Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
- Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
- Bryers, J. D.
- Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
- Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
- Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
- Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
- Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
- Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
- Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).
