一个<em>在体外</em>准备从纯化的蛋白质和细胞裂解液的功能性糖皮质激素受体(GR)•HSP90蛋白复合物的方法描述。该方法利用免疫吸附的盐剥离和蛋白质复合体重组重组的GR。辅助因子和缓冲条件的重要性进行了讨论,作为潜在的方法应用。
HSP90是一个重要和非常丰富,已发现调节超过150个的真核细胞信号蛋白,包括转录因子(如核受体,P53),并参与细胞周期蛋白激酶(如SRC,英国皇家空军,Akt激酶)的分子伴侣蛋白,肿瘤的发生,细胞凋亡和多种真核细胞信号转导通路1,2。许多这些“客户”HSP90蛋白,类固醇受体大会•HSP90复合物是最好的定义( 图1)。我们在座的适应性强的糖皮质激素受体 (GR)的免疫测定和体外GR•HSP90重组的方法,可随时用来探测HSP90真核细胞的功能活动,HSP90介导的类固醇激素受体 配体的结合,以及分子伴侣辅助因子的要求。例如,此法可用于测试HSP90的辅助因子的要求和加入外源性化合物的重组进程的影响。
遗传资源已经为研究HSP90一个特别有用的系统,必须绑定到HSP90,因为受体有一个开放的配体结合裂访问类固醇 3 。内源性的,unliganded的GR非共价的约束,以HSP90的哺乳动物细胞的细胞质中。如发现内源性GR•HSP90 heterocomplex,GR配体结合裂,是开放的和有约束力的类固醇的。如果从GR HSP90不赞成或如果其功能受到抑制,受体是无法绑定类固醇和需要重组的GR•HSP90 heterocomplex的结合活性类固醇之前恢复 4 。遗传资源,可以从细胞细胞质使用单克隆抗体免疫沉淀,如HSP90蛋白复合物,以遗传资源,可以通过免疫印迹检测。免疫沉淀的GR结合活性的类固醇,可以由孵化与[3H]类固醇immunopellet 。
以前的实验已经证明HSP90介导的GR配体裂约束力的开放需要HSP70,第二个分子伴侣,也为真核细胞的活力至关重要。 HSP90和HSP70的生化活性催化合作伴侣蛋白合,hsp40,和P23 5 。一个多蛋白的伴侣机械HSP90,HSP70,合,和hsp40是在真核细胞的细胞质内源性目前,网织红细胞裂解液提供了一个伴侣,含有丰富的蛋白质来源6。
提出的方法,GR是immunoadsorbed从细胞细胞质和内源性hsp90/hsp70伴侣用温和的盐条件下的机械剥离。盐剥离的GR然后孵育•HSP90 heterocomplex和类固醇的结合活性的激活7,网织红细胞裂解液,三磷酸腺苷,和K +,这在重组的GR结果。可以利用这种方法来测试各种伴侣的辅助因子,新的蛋白质,和实验HSP90或GR抑制剂的影响,以确定其HSP90介导的类固醇具有约束力8-11的功能意义。
上文所述的检测可以适应测试无数影响hsp90/hsp70-based伴侣机械伴侣行动以及GR类固醇具有约束力的条件。这是以前报道的方法 4,8,9,17的修改,旨在充分利用电泳技术的最新进展,并接触到更广泛的研究界。可以添加额外的辅助因子或蛋白质的利益,在GR•HSP90 heterocomplex重组的混合物,在本议定书第4步中所述,以观察对类固醇的约束力,heterocomplex蛋白质相互作用,并共同因素的要求影?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由国家健康授予GM086822,希望心脏研究所的基础科学奖,兆焦耳默多克慈善信托基金科学学院研究计划研究院资助。选择电泳试剂和图像分析软件Bio – Rad公司提供的慷慨。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |